תאי גזע תכנות טיפולי אנגיוגנזה שימוש אורגניים פולימריים חלקיקים
27 בספטמבר 2013
אנו מתארים את השיטה של תאי גזע תכנות לביטוי יתר גורמים טיפוליים לאנגיוגנזה באמצעות חלקיקים פולימריים מתכלים. תהליכים שתוארו כוללים סינתזת פולימר, transfecting בתאי גזע שמקורם בשומן במבחנה, ומאמת את היעילות של תאי גזע מתוכנתים לקדם אנגיוגנזה במודל איסכמיה hindlimb עכברי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השימוש בננו-חלקיקים פולימריים לביטוי יתר של גנים טיפוליים בתאי גזע באמצעות מודל איסכמיה של גפיים אחוריות ימיות. זה מושג על ידי סינתזה תחילה של פולימרים מתכלים באמצעות תגובת מהדורת מיקרופון דו-שלבית, ולאחר מכן ייצור ננו-חלקיקים פולימריים המקודדים גנים טיפוליים. השלב השני הוא להעביר תאי גזע שמקורם בשומן אנושי במבחנה לגורם גדילה אנדותל כלי דם.
לאחר מכן, תאי גזע מתוכנתים מוזרקים תוך שרירית לגפה אחורית איסכמית לייצור NC 2 של גורמים טיפוליים. השלב האחרון הוא ניטור הישרדות התאים וזלוף הדם בגפה האיסכמית לאורך זמן באמצעות הדמיית ביולומינסנציה והדמיית דופלר בלייזר. בסופו של דבר, ניתן לבצע ביטוי גנים כמותי והיסטולוגיה כדי להראות ביטוי מקומי של גורמים טיפוליים ויעילות של התחדשות רקמות.
היתרון של טכניקה זו על פני שיטות קונבנציונליות לאנגיוגנזה הוא השימוש בתאי גזע ככלי להעברת תרופות. אסטרטגיה זו מאפשרת לנו להשתמש ביכולת החידוד הטבעית של תאי גזע כדי לנדוד לעבר איסכמיה, וגם מאפשרת תגובות דינמיות לרמזים מיקרו-סביבתיים. הננו-חלקיקים המשמשים להעברת DNA בפלזמה הם יעילים ומתכלים ביותר, ומאפשרים ציטוטוקסיות נמוכה יותר ומספר גדול יותר של עותקי DNA המועברים תוך תאיים.
ניתן ליישם טכניקה זו על טיפולים מבוססי תאים רלוונטיים מבחינה קלינית מכיוון שהיא משתמשת בווקטור לא ויראלי מתכלה כדי להחדיר גנים לתאים אוטולוגיים עובדים במכסה אדים, שוקלים את ה-DLI של חוגת הבוטאן ומעבירים את החומר לבקבוקון אינהלציה מזכוכית המכיל מוט ערבוב. לאחר מכן, הוסף חמישה פנטול חומם מראש לאותו בקבוקון. הניחו מיד את הבקבוקון על צלחת ערבוב והגדירו את המהירות ל-600 סל"ד.
מעבירים את הבקבוקון לתנור בחום של 90 מעלות ומגבירים את מהירות הערבוב ל-1000 סל"ד לאחר ארבע שעות, מנמיכים את המהירות ל-300 סל"ד ומערבבים עוד 12 עד 16 שעות. כשהוא מוכן, הוסף 10 מיליליטר טטרה הידרו אוראן נטול מים לחמישה גרם C 32 בבקבוקון זכוכית המכיל מוט ערבוב. לאחר עטיפה במערבולת נייר כסף גבוהה עד להמסה מלאה בבקבוקון זכוכית נפרד המכיל מוט ערבוב, הוסף 10 מילימולר של טטרה אתילן גליקול דיאמין.
הוסף 40 מיליליטר THF לבקבוקון זה, הניח את שני הבקבוקונים על צלחת ערבוב למשך חמש דקות לפני שילובם יחד. מכסים את התוצאה בנייר כסף ומניחים לו לבהות בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. התוצר הסופי נקרא C 32 1 22.
לאחר מכן העבירו 30 מיליליטר של אתר דתיל נטול מים לכל אחד מחמישה צינורות בז של 50 מיליליטר. לאחר הוספת C 32 1 22 לאתר דיל נטול מים, תמיסה עכורה לבנה יוצרת מערבולת של הצינור ולאחר מכן צנטריפוגה אותו. הפולימר המופק יתאסף בבסיס הצינור, יזרוק את התמיסה העליונה ויחזור על שלבים אלה פעמיים נוספות.
לאחר החילוץ, הניחו את הצינורות הפתוחים בחומר הייבוש ושאבו למשך הלילה, וודאו שהצינורות מוגנים מפני אור. למחרת שקלו את הצינורות המכילים C 32 1 22 כדי לקבוע את המסה הסופית. לבסוף ממיסים את הפולימר המופק ב-DMSO נטול מים בריכוז של 100 מיליגרם למיליליטר.
להכנת ננו-חלקיקים. תחילה לדלל DNA פלזמה לריכוז סופי של 120 מיקרוגרם למיליליטר בנתרן אצטט בשפופרת שנייה לדלל C 32 1 22 לריכוז סופי של 3.6 מיליגרם למיליליטר. בנתרן אצטט, שלבו את התוכן של כל שפופרת לתוך שפופרת פלקון אחת של 15 מיליליטר ומערבולת מיד בעוצמה גבוהה למשך 10 שניות.
הניחו לצינור לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי שהיווצרות ננו-חלקיקים תתרחש בזמן שהננו-חלקיקים נוצרים. החלף את המדיום בבקבוק תרבית רקמה שישב בעבר ב -7.8 מיליליטר. תוספת מלאה של DHEM.
העבירו את תמיסת הננו-חלקיקים לבקבוק תרבית הרקמה ופזרו אותה באופן שווה לפני הכנסתם לחממה. לאחר שעתיים, החלף את המדיה המכילה ננו-חלקיקים ב-DMEM. לאחר ארבע שעות, התאים מוכנים להזרקה in vivo.
כאשר התאים המועברים מוכנים, ספירת התאים בצפיפות של 10 כפול 10 מתוך ששת התאים למיליליטר ב-PBS כדי להבטיח שכל עכבר יקבל כמות שווה. הפרד את מתלי התאים לצינורות עינור בנפח של 110 מיקרוליטר. לאחר מכן, יש להרדים עכבר שעבר בעבר איסכמיה בגפיים האחוריות.
לאחר אישור ההרדמה על ידי צביטת הבוהן, נקה את מקום ההזרקה עם מזרק בגודל 27. השעו מחדש את התאים ומשכו 100 מיקרוליטר מהמתלה. הזרקו מחצית מתרחיף התאים לאזור שריר המקרב ולאחר מכן הזריקו את החצי השני לאזור שריר השוקיים.
לאחר ההזרקה, השאר את המזרק במקומו למשך 15 עד 30 שניות לפחות כדי למנוע דליפה. בסיום הזריקות, שמור על חום החיה עד להחלמה מלאה. להדמיית ביולומינסנציה, אשר את ההרדמה עם צביטה בבוהן ולאחר מכן נקה את מקום ההזרקה כפי שהוצג קודם לכן.
מלאו מזרק אינסולין ב -100 מיקרוליטר לוציפר והזריקו אותו תוך צפק. לפני שמכניסים את החיה לתא ההדמיה של ivus Luciferase, דמו את העכברים עם זמן חשיפה של דקה אחת. כאשר התמונה נרכשת, סמן את אזור העניין.
במקרה זה, הגפה האיסכמית באתר הזרקת התא ממשיכה למדוד את אות הלוציפראז כל שלוש עד חמש דקות עד שהאות מגיע לשיא ומתחיל לרדת. זהו הערך המשמש להשוואה בין עכברים ולאורך נקודות זמן לאחר השלמתו, הוציאו את העכברים מהתא ושמרו על חום החיה עד להחלמה מלאה. רקמות נקצרות בזמן נבחר.
נקודות לאחר טרנספקציה לאחר המתת חסד, חותכים את העור המקיף את הגפה האחורית בצורה היקפית באזור הבטן הדיסטלי ופרוקסימלי לגפה האחורית. לאחר משיכת העור לאחור, יש לקטוע את הגפה בין האגן למפרק הירך. לבסוף, המקרב המדיאלי ושרירי הגסטרוק מבודדים.
לניתוח נוסף, תמונות אלה מתארות את הסינתזה של C 32 1 22. כאן, C 32 AC מסתיים הקשור ל-ACR נוצר על ידי תגובת מהדורת מיקרופון בין מונומר עם קבוצות קצה DAL ומונומר עם קבוצת קצה ממוצעת ראשונית. בדוגמה זו ניתן ליצור פולימרים PBAE מותאמים על ידי הוספת מונומרים עם סיומות ממוצעות ליעילות טרנספקציה משופרת.
טרנספקציה מוצלחת ניכרת על ידי ביטוי יתר של חלבון פלואורסצנטי ירוק כפי שניתן לראות כאן. נתוני הדמיית ביולומינסנציה אלה מראים עכבר ביום האפס וביום ה-14. לאחר הזרקת תאי גזע שמקורם בשומן חיובי GFP לוציפראז לגפה האחורית, תמונות דופלר מייצגות מדגימות השראת איסכמיה בצד אחד של הגפה האחורית המשקפת ביום האפס וזלוף דם מוצלח.
14 יום לאחר הזרקת VEGF יתר על ביטוי תאי גזע שמקורם בשומן. R-T-P-C-R אישר את הוויסות המוצלח של VGF, החלבון הטיפולי המקודד בקבוצה המטופלת ארבעה ימים לאחר הזרקת התא, בעוד שלא זוהה ביטוי בביקורת PBS. ניתן לבצע שיטות אחרות המיישמות גישה משולבת של תאי גזע והעברת גנים על מנת לזהות מטרות טיפוליות חדשות לקידום התחדשות רקמות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז פולימרים מתכלים לטיפול גנטי לא ויראלי ולהשתמש בפולימרים אלה כדי לתכנת תאי גזע לטיפול באיסכמיה ו-vivo שימוש בתאי גזע מהונדסים לא ויראליים לביטוי יתר של גורמים טיפוליים באתרם עשוי להיות שימושי באופן נרחב לטיפול במגוון רחב של מחלות ניווניות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שימוש בננו-חלקיקים פולימריים מתכלים ביולוגית לתכנות תאי גזע לביטוי יתר של גורמים טיפוליים שמטרתם לעודד אנגיוגנזה. השיטה תוקפה באמצעות מודל של איסכמיה ברגל האחורית של עכבר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- טיפול בתאי גזע
- אנגיוגנזה
- ננו-חלקיקים מתכלים ביולוגית
רקע
- ביטוי יתר גנטי טיפולי יכול להגביר רגנרציה של רקמות.
- ננו-חלקיקים פולימריים משמשים ככלי הובלה יעילים עבור גנים.
- תאי גזע המופקים מרקמה שומנית מהווים מקור מבטיח לרפואה רגנרטיבית.
- מודלים של איסכמיה בגפה האחורית משמשים באופן נפוץ לחקר אנגיוגנזה.
מטרת המחקר
- לתכנת תאי גזע לביטוי יתר של גורם גדילה אנדותליאלי כלי דם (VEGF).
- להעריך את יעילותם של תאי גזע מתכנתים אלו בקידום אנגיוגנזה.
- לבחון את הפוטנציאל של ננו-חלקיקים מתכלים ביולוגית בהעברת גנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סינתזה של פולימרים מתכלים ביולוגית באמצעות תגובה דו-שלבית.
- ייצור של ננו-חלקיקים פולימריים המקודדים גנים טיפוליים.
- טרנספקציה של תאי גזע אנושיים המופקים מרקמת שומן in vitro.
- הזרקה של תאי גזע מתכנתים לגפיים אחוריות איסכמיות לצורך הערכה.
תוצאות עיקריות
- טרנספקציה מוצלחת של תאי גזע שהובילה לביטוי יתר של VEGF.
- שיפור בפרפוזיית הדם שנצפתה בגפה האיסכמית.
- ניתוח כמותי של ביטוי גנים אישש ביטוי מקומי של גורמים טיפוליים.
- הערכות היסטולוגיות הדגימו רגנרציה של רקמות.
מסקנות
- ננו-חלקיקים פולימריים מתכלים ביולוגית מעבירים ביעילות גנים טיפוליים לתאי גזע.
- תאי גזע שעברו תכנות יכולים להגביר משמעותית את האנגיוגנזה בתנאים איסכמיים.
- שיטה זו מבטיחה פוטנציאל לטיפולים רגנרטיביים עתידיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
גישה זו נותנת מענה לאתגר של הובלה ממוקדת וממושכת של גורמים אנגיוגניים בשיקום רקמות איסכמיות, תוך ניצול תופעת ה-homing של תאי גזע ווקטורים לא-ויראליים מתכלים כדי לשפר את הדיוק הטיפולי. באמצעות תכנות תאי גזע אוטולוגיים לבטא באופן יתר את VEGF in situ, השיטה מגבירה את הביטחון החיזוי במודלים פרה-קליניים של אנגיוגנזה ותומכת בהפחתת סיכונים של אסטרטגיות רגנרטיביות מבוססות תאים. היא מאפשרת פלטפורמה ניתנת להעברה ליישומים של מחלות איסכמיות שבהם צמיחה כלי דם מבוקרת היא קריטית לרגנרציה של רקמות ולהגלידה של פצעים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מסלולים אנגיוגניים המונעים על ידי VEGF באמצעות ביטוי יתר מבוקר בתאי גזע.
- ערך תפעולי: משתמש בתאי גזע המופקים מרקמת שומן ככלי הובלה אותולוגי וניתן להרחבה עבור גנים טיפוליים.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור ביטוי גנים לתוצאות פונקציונליות של רפרפוזיה in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מערכת סטנדרטית להערכת יעילות העברה של גנים ללא נגיף בתאי גזע באמצעות ביטוי יתר של VEGF.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה כמותית של ביטוי הגן המועבר ותגובה אנגיוגנית באמצעות ביולומינצנציה ודימות דופלר.
- ערך מדעי: תומך בשחזור הבדיקה באמצעות פורמולציה סטנדרטית של ננו-חלקיקים ופרוטוקולים סטנדרטיים לטרנספקציית תאי גזע.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים אנגיוגנזה טיפולית במודל של איסכמיה בגפה האחורית של עכבר, ובכך מתקף את ביצועי המערכת הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר ניטור ארוך טווח של הישרדות תאים ופרפוזיה חוזרת של דם, ובכך מאפשר הערכת יעילות לאורך זמן.
- ערך מדעי: מקשר בין ביטוי VEGF מקומי לבין נקודות סיום של התחדשות רקמה, ובכך תומך בהלימה של סממנים ביולוגיים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, מהנדסת תאי גזע ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך תומכת בבחינת השערות בנושא אנגיוגנזה ומאפשרת תהליכי עבודה ניתנים להרחבה לטיפול בתאים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בחקירת נתיב ה-VEGF ובתיקוף של מטרות באמצעות ביטוי יתר הניתן להשראה בתאי גזע.
- סריקה: מאפשר הערכה סטנדרטית של יעילות העברת הגנים ושל פוטנציאל אנגיוגני in vitro ו-in vivo.
- אנליזה: מייצר מדדים כמותיים של ביטוי גנים, ביולומינצנציה ופרפוזיה לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מדגים רציפות מתכנות תאי גזע ועד לאנגיוגנזה תפקודית ברקמה איסכמית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה של וקטור לא-ויראלי לשימוש חוזר לצורך תכנות תאי גזע עבור מטרות גנים טיפוליות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות אנגיוגניות באמצעות ביטוי גורמים מבוקר ומקומי.
- ערך תפעולי: מציע מערכת הובלה לא-ויראלית ומתכלה ביולוגית עם ציטוטוקסיות נמוכה ויכולת טעינת DNA גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באנגיוגנזה המתווכת על ידי תאי גזע.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של VEGF ומטרות אנגיוגניות אחרות בתוכניות למחלות איסכמיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בכימיה של פולימרים, ניסוח ננו-חלקיקים, ותרבית ותעתוק (transfection) של תאי גזע.
- נדרשת גישה לציוד לאטמוספירה אינרטית עבור סינתזת פולימרים ולמתקני תרבית תאים סטריליים לצורך תעתוק.
- נדרש סטנדרטיזציה של גודל הננו-חלקיקים, המטען וטעינת ה-DNA בין סדרות ייצור שונות כדי להבטיח תעתוק הניתן לשחזור.
- נדרשת התאמה של פרוטוקולי המינון וההזרקה בעת מעבר בין מקורות שונים של תאי גזע או מודלים איסכמיים שונים.
- מוגבל על ידי הצורך בתשתית דימוי in vivo למעקב ארוך טווח אחר הישרדות התאים והיעילות הטיפולית.
