בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות
25 בנובמבר 2013
אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels של רקמות ואיברים אחרים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד צינורות תאי אנדותל מהעורק האפיגסטרי העליון של העכבר או SEA כדי לחקור את דינמיקת האיתות התוך-תאית והבין-תאית של אנדותל מיקרו-וסקולרי שלם מקומי. זה מושג על ידי בידוד ראשון של ה-SEA מדופן שרירי השלד בבטן העכבר. בשלב השני, הכלי מתעכל בעדינות ובאופן סומטי, ולאחר מכן עובר TATed בזהירות כדי לנתק את תאי השריר החלק והאדוונטיטיה מצינור תאי האנדותל.
בשלב האחרון, הצינור מאובטח בתא זרימה ומתמזג סופר עם תמיסת מלח פיזיולוגית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהדמיה קונפוקלית כדי לדמיין איתות סידן בצינור האנדותל המיקרו-וסקולרי השלם המקורי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תרבית תאי אנדותל, הוא שתאי האנדותל המרכיבים את הצינור ושומרים על המורפולוגיה הטבעית שלהם, ביטוי החלבון וההיענות שלהם, האנדותל הוא חלק בלתי נפרד מבקרת זרימת הדם בכל הגוף.
היישום של טכניקה זו מאפשר לנו לחקור אירועי איתות בין תאים המתווכים את בקרת זרימת הדם וכיצד הם עלולים להשתבש במהלך תפקוד לקוי של כלי הדם. כדי לבודד את ה-SEA תחילה, בצע חתך קטן דרך העור ממש מעל אזור אזור הערווה של עכבר מורדם, האריך את החתך לרוחב לכל כיוון לגפיים האחוריות המתאימות, ולאחר מכן המשך את סיבוב החתך לאורך קו האמצע הגחוני עד לראש כלוב הצלעות, והאריך עוד יותר את החתך לרוחב לכל כיוון לארבע הגפיים המתאימות. כעת הרם בעדינות את העור וחתוך את רקמת החיבור המחזיקה את העור לשריר הבסיסי, תוך חשיפת כל שטח שרירי הבטן.
להשקות את השריר החשוף בתמיסת מלח בטמפרטורת החדר. ואז תחת מיקרוסקופ סטריאו, הרם את כרית השומן הממוקמת בתחתית עצם החזה. בצע חתך דרך כרית השומן ולאורך הצלע התחתונה.
ה- SEA צריך להיות גלוי כעת, תוך הקפדה לא לפגוע בעורק, להשקות את הרקמה החשופה בטמפרטורת החדר יותר, תמיסת מלח. לאחר נסיגת השכבה העליונה של שרירי השלד, שימו לב לאורך ה-SEA ולאחר מכן כרתו בזהירות את שכבת השריר הדקה מתחת לעורק. לאחר מכן, השתמש במלקחיים זוויתיים כדי להעביר תפר משי באורך של שישה או מתחת ל-SCA.
לאחר מכן קשרו את העורק ואת הווריד הסמוך לו כדי לשמור עליו בלחץ ולשמור על הדם בתוך לומן הכלי. לאחר קשירת ה-SCA בצד הנגדי, בצע חתך לאורך קו האמצע של שרירי הבטן כדי להפריד בין הצדדים המתאימים, ולאחר מכן הארך את החתך לרוחב לכל כיוון כפי שנעשה לעור. המשך את החתך אנכית לאורך הקצה החיצוני כדי להפריד לחלוטין את שריר הבטן מהגוף.
לאחר מכן חתכו את ה-SEA מעל הקשירה כדי לשמור על האיטום והניחו את השריר והעורק המבודדים בכוס של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של מאגר דיסקציה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר בידוד השריר מהצד השני של הבטן, דגרו את הרקמות במאגר דיסקציה למשך 10 דקות. כעת, הנח את שריר הבטן המכיל את ה-SEA בצלחת פטרי של ארבע מעלות צלזיוס המצופה בשכבת מגן ציל ומכילה מאגר דיסקציה השתמש בסיכות חרקים של 0.15 מילימטר כדי למתוח את ה-SEA והשריר לאורכי ה-in vivo המשוערים שצוינו קודם לכן.
אבטח את ה-SEA למגן הגליל המכוון את השריר כך שהשכבה הדקה הפונה לצפק תהיה למעלה. לאחר מכן, בעבודה מאתר הקשירה במעלה הזרם לכיוון הקצה במורד הזרם, נקה כסנטימטר עד שני סנטימטר מה-SEA מהווריד הזוגי שלו והרקמה שמסביב עד לאתר הענף העיקרי הראשון. חותכים את ה-SEA ממש מעל אתר הסניף וממש מתחת לקשירה.
לאחר מכן, השתמש בחתיכת צינור אלסטי כדי לחבר את הקצה האחורי של פיפטה למזרק של חמישה מיליליטר המכיל מאגר חיתוך קר כקרח. אבטח את קצה פיפטת הקנולציה בתוך תא הדיסקציה וקנה את ה-SEA. לאחר מכן, לאחר שכל האריתרוציטים נשטפו החוצה, הסר את ה-SEA מפיפטת הקנולציה והסר את הפיפטה מצלחת הדיסקציה כדי לבודד את צינורות האנדותל.
ראשית, מלאו צינור תרבית זכוכית בגודל 12 על 75 מילימטר באמצע הדרך במאגר חיתוך קר כקרח. לאחר מכן, לאחר חיתוך ה-SEA לחתיכות של מילימטר עד שלושה מילימטרים, השתמש במלקחיים זוויתיים כדי להעביר את חלקי העורקים לתוך צינור התרבות ולהניח את הצינור על קרח. לאחר מכן, שלב אנזימי עיכול עם מאגר הדיסוציאציה לנפח סופי של מיליליטר אחד בצינור תרבית נפרד בגודל 12 על 75 מילימטר וחמם מראש את תמיסת האנזים ל -37 מעלות צלזיוס עם בלוק חימום.
הסר את צינור התרבית המכיל את חלקי העורקים מארבע מעלות צלזיוס והנח אותו בטמפרטורת החדר כדי להתחמם בזמן שתמיסת האנזים מתחממת ל-37 מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות את מאגר החיתוך בטמפרטורת החדר מצינור התרבית, והשאירו נפח קטן המכיל את מקטעי הכלי. כעת הוסיפו לאט לאט את טמפרטורת החדר, מאגר דיסוציאציה ללא אנזימים לקטעי כלי הדם כך שחלקי העורקים יישארו בתחתית צינור התרבית כדי לשטוף את כל מאגר הדיסקציה שנותר.
לאחר שתמיסת האנזים הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס, שאפו שוב את מאגר הדיסוציאציה מצינור התרבות המכיל את מקטעי הכלי, והשאירו נפח קטן המכיל את מקטעי הכלי. כעת העבירו את תמיסת האנזים של 37 מעלות לצינור התרבות ודגרו את צינור התרבות בגוש החימום למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה, הכינו פיפטה אוריינית ממולאת בשמן מינרלי, קלעו את הפיפטה, עשו הפסקה נקייה, שברו את הפיפטה באש מלקחיים, לטשו את קצה הפיפטה ואבטחו אותה על מזרק מיקרו המותקן במניפולטור מיקרו
.לאחר מכן החזר את בוכנת המזרק המיקרו כדי למלא את הפיפטה בשני ננוליטר של מאגר דיסוציאציה ומקם את קצה הפיפטה מעל תא הזרימה בסוף הדגירה. לאחר שאיבת המאגר בזהירות כפי שהודגם זה עתה, שטפו את מקטעי העורקים בארבעה מיליליטר של מאגר דיסוציאציה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו בעדינות קטע כלי אחד עם מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד והניחו את הכלי בתא זרימה עם מיליליטר אחד של מאגר הדיסוציאציה.
מקם את קצה פיפטת הטאטציה ליד קצה אחד של קטע הכלי, ולאחר מכן שאב את מקטע הכלי לתוך פיפטת הטאטציה במהירות של כ-225 ננוליטר לשנייה, כדי לא לגרום לעומס מכני לתאי האנדותל, פלט את הכלי בחזרה לתא. אם העיכול הצליח, תאי השריר החלק והאדוונטיטיה ינותקו מצינור האנדותל. הרחיקו את האדוונטיטיה מצינור האנדותל בהקדם האפשרי כדי למנוע ממנה לסבך את הצינור, ולאחר מכן חזרו על הפעולה כפי שהודגם זה עתה עד שכל תאי השריר החלק מתנתקים.
לאחר האיטרציה הסופית, ASEE והציב את צינור האנדותל המבודד במרכז תא הזרימה, מיושר לאורך כיוון הזרימה והסיר את הפיפטה המפעילה. אבטח פיפטות הצמדה במניפולטורים מיקרו המותקנים בשני קצות תא הזרימה ולאחר מכן מקם את קצותיהם בקצוות המתאימים של צינור האנדותל. הורד את פיפטות ההצמדה, אחת בכל פעם על קצוות מנוגדים של הצינור, ולחץ את הצינור על תחתית החדר, כ- 50 מיקרומטר מכל קצה הצינור.
בדיוק כאשר פיפטת ההצמדה נוגעת בצינור, משוך אותה לאט לאורך ציר הצינור, והאריך אותה לאורכה המשוער in vivo. לחץ את הפיפטה על תחתית התא כדי לאבטח את הצינור, ולאחר מכן התחל את זרימת תמיסת הסופר-פיוז'ן באמצעות משאבה פריסטלטית כדי לשמור על זרימה קבועה של תמיסת הסופר-פיוז'ן על פני צינור האנדותל. בתמונת ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות זו, מוצג צינור תא אנדותל מבודד מ-SEA עוקב, היתוך על של שעה אחת עם מאגר היתוך בשלושה מיליליטר לדקה בטמפרטורת החדר.
סרט זה מדגים את תגובות הסידן של צינור תאי אנדותל טעון שפעת בתגובה לגירוי אצטילכולין מיקרו-מולרי אחד. תמונות פלואורסצנטיות מייצגות אלה נאספו בנקודות זמן שונות לאחר גירוי צינור האנדותל עם אצטילכולין. שימו לב כיצד הסידן התוך-תאי מתנדנד עם הזמן.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מפגיעה מכנית בצינור האנדותל במהלך מיקום משולש והצמדה מכיוון שתאי האנדותל עדינים ביותר ונפגעים בקלות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבודד צינורות אנדותל מהעורק האפיגסטרי העליון של העכבר, ובכך לחקור אנדותל מיקרו-וסקולרי שלם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לוויזואליזציה ומניפולציה של איתות סידן באנדותל מיקרו-וסקולרי טבעי. הטכניקה כוללת בידוד של צינורות אנדותל מעורקי התנגדות של עכבר, השומרים על המורפולוגיה שלהם in vivo ועל יכולות איתות דינמיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעיו של המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה וסקולרית
רקע
- האנדותל ממלא תפקיד מכריע בויסות זרימת הדם.
- הבנת איתות הסידן בתאי אנדותל חיונית לחקר התפקוד הכלי.
- שיטות מסורתיות כוללות לעיתים קרובות תרבית תאים, דבר שעלול לשנות את מאפייניהם הטבעיים.
- טכניקה זו מאפשרת לחקור תאים בסביבתם הטבעית.
מטרת המחקר
- לבידוד צינוריות תאי אנדותל לצורך חקירת דינמיקות של סיגנלינג תוך-ותבין-תאי.
- לשימור המורפולוגיה המקורית והתגובתיות של תאי אנדותל.
- לחקירת אירועי סיגנלינג השולטים בזרימת דם והשלכותיהם על תפקוד לקוי של כלי דם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של העורק האפיגסטרי העליון (superior epigastric artery) משריר שלד בבטנו של עכבר.
- עיכול עדין של כלי הדם כדי להפריד תאי שריר חלק מצינורות אנדותליאליים.
- קיבוע הצינור בתא זרימה לצורך דימות.
- שימוש בדימות קונפוקאלי להדמיית איתות סידן.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של צינורות אנדותליאליים השומרים על מאפייניהם in vivo.
- ויזואליזציה של דינמיקת אותות סידן באנדותל מיקרו-וסקולרי שלם.
- הדגמת יתרונות הטכניקה לעומת שיטות מסורתיות של תרביות תאים.
- תובנות לגבי מנגנוני האיתות המווסתים את זרימת הדם.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי רב-עוצמה לחקר השיגנלינג של תאי אנדותל.
- היא משפרת את הבנתנו לגבי תפקוד וליקוי תפקודי כלי דם.
- ניתן להחיל גישה זו על רקמות ואיברים אחרים למשמעויות מחקריות רחבות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד של צינורות אנדותל מיקרו-וסקולריים שלמים מאפשר מחקר ישיר של דינמיקת איתות הסידן הטבעית ללא השפעות מטריות של שריר חלק או רכיבי דם. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות בביולוגיה של כלי דם על ידי שימור תקשורת בין-תאית פיזיולוגית באמצעות צמתי פער (gap junctions). השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלות לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של תרכובות המשפיעות על תפקוד האנדותל ועל ויסות זרימת הדם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי שמירה על מורפולוגיה אנדותליאלית טבעית וביטוי חלבונים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות שימור סיגנלינג בין-תאי דרך צמתי פער (gap junctions).
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד מסלולי סיגנלינג של סידן הספציפיים לאנדותל.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת צינורות אנדותליאליים סטנדרטיים למדידות שטף כמותיות בתאי סופרפוזיה.
- שחזוריות: יצירת תכשירים עקביים השומרים על תגובתיות טבעית לאגוניסטים כגון acetylcholine.
- יכולת הרחבה: תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת תרכובות המשפיעות על מסלולי התרחבות כלי דם תלויי סידן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה אנדותל מיקרו-וסקולרי מעורקי התנגדות, החיוניים לבקרת פרפוזיה של רקמות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאימות פרה-קלני על ידי שימור ארכיטקטורת הסיגנלינג המקורית.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות go/no-go על סמך מנגנון פעולה ספציפי לאנדותל.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת מדדים תפקודיים ספציפיים לאנדותל לפני קמפיינים של סריקה פנוטיפית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבירור מסלולים באמצעות בידוד דינמיקת אותות סידן ברשתות מיקרו-וסקולריות שלמות.
- סריקה: מספקת תכשירים מוכנים לבדיקה עם פלטי זרימה כמותיים להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה של תנודות סידן תוך-תאיות כמדד תפקודי לוויסות מסלולים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רצף מהשלב של הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני על ידי שימור תכונות רקמה אנדותליאלית טבעיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת יכולת ניתנת לשימוש חוזר לחקר תפקוד לקוי של האנדותליום ברחבי מיטות כלי דם שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה באמצעות שימור איתות אנדותליאלי טבעי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור של הכשרות צינורות אנדותליאליים בין ניסויים שונים.
- ערך אסטרטגי: הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי הפחתת סיכונים במנגנונים אנדותליאליים בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון של תרכובות המכוונות לוויסות טונוס כלי דם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של מיקרו-vessels ובהכנה אנזימטית של רקמות.
- תלוי בתאי פרפוזיה ובמערכות דימוי סידן לקבלת מדדים תפקודיים.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד כלי דם ולהפרדה של שריר חלק.
- שיקולי התאמה כוללים שונות בגודל כלי הדם בין דגמים ומינים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את שבירותם של צינוריות האנדותל במהלך הטיפול והגדרת הפרפוזיה.
