דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג מפת הידבקות מוחלטת של הידבקות חלקיקי התא מניסוי יחיד באמצעות רשתות מיקרו-וסקולריות סינתטיות. זה מושג על ידי ציפוי תחילה של המכשיר המיקרופלואידי, בחלבון המעניין במקרה זה, avadon. כשלב שני, חלקיקים ביוטיניליים מוזרקים למכשיר בקצבי גזירה פיזיולוגיים, הנקשרים למכשיר המצופה avadon עם דפוסים דיפרנציאליים בהתאם לשיעורי הגזירה המקומיים.

לאחר מכן, מספר החלקיקים הקשורים נספר על מנת ליצור מפת הידבקות מוחלטת של החלקיקים באמצעות מסד נתונים שנוצר באופן חישובי של ערכי קצב עצום ברשת. התוצאות מראות כי ניתן להשיג מפת הידבקות טהורה מניסוי יחיד וכתוצאה מכך חיסכון משמעותי בזמן וריאגנטים בהשוואה לתאי זרימת הלוחות המקבילים הקונבנציונליים. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו על פני שיטות קיימות, כגון ערוצי זרימה ליניאריים, הוא שאנו יכולים לייצר מפות משותפות מניסוי בודד וכתוצאה מכך חיסכון משמעותי בעלויות ובזמן.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום אספקת התרופות, כגון היכולת של כלי אספקת התרופות להיקשר למטרות הרצויות. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר השתמשנו בתאי זרימה של לוחית ההנעה להבנת נגע מסוים בתא. עם זאת, בתנאי נוזלים, המוקד של בדיקה זו הוא לספק תובנות בסיסיות לגבי הידבקות החלקיקים והתאים.

ניתן ליישם את פלטפורמת syn vivo על מגוון מערכות אחרות כגון סרטן והעברת מערכת העצבים המרכזית, זיהום ודלקת, פקקת ותפקוד לקוי של מיקרו-סירקולציה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי המכשיר המיקרו-נוזלי, מתרגלים לנפחי דגימה קטנים, והשיטות המומלצות למניעת היווצרות בועות מועברות טוב יותר באופן ויזואלי. תדגים את ההליך אשלי סמית', מדענית חוקרת מהמעבדה שלנו.

המכשיר המיקרופלואידי SynVivo SMN מורכב משתי קבוצות של יציאות מקבילות, האחת לזרימה בציפוי פני השטח, חלקים ו/או תאים לישיבה, והשנייה להפעלת הבדיקה. כדי להתחיל, טבלו את המכשיר לחלוטין בצלחת פטרי המכילה מים סטריליים נטולי יונים והניחו את הכלי בוואקום. ייבוש מאפשר לייבוש לפעול עד להסרת כל האוויר מתעלות המכשיר.

זה אמור לקחת כ-15 דקות לפני הוצאת המכשיר מהמים. השתמש במלקחיים עדינים כדי למקם צינורות טיגון מוכנים במים בכל יציאה של המכשיר. הצינור צריך להיות באורך של כסנטימטר אחד.

כעת ניתן להסיר את המכשיר מהמים באמצעות פיפטה או מזרק. הנח טיפת מים סביב בסיס צינור יציאת כניסה אחד. הסר בזהירות את הצינור.

טיפת המים תמנע כניסת אוויר למכשיר. לאחר מכן, הכינו מזרק מיליליטר אחד עמוס באבדון בריכוז של 20 מיקרוגרם למיליליטר. חבר את המזרק למחט וצינורות נירוסטה בגודל 24 מהדק את יציאת הכניסה שאינה בשימוש עם לסת clamp.

הכנס את הצינור ליציאת הכניסה של המכשיר. הזריק avadon בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לדקה למשך 10 דקות כדי לאפשר זלוף מלא של המכשיר. בסוף זמן הזרימה.

מהדק את כל הצינורות בעזרת מהדקי הלסת והנח את המכשיר בארבע מעלות למשך הלילה. אפשר למכשיר להגיע לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הנח את המכשיר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד בבמה ממונעת ומצלמה בעלת ביצועים גבוהים.

הכן תמיסה של שני חלקיקים ביוטיניליים מיקרוניים בריכוז של 5 מיליון חלקיקים למיליליטר במי מלח פוספט או PBS. טען את החלקיקים למזרק מיליליטר אחד. הכן מזרק שני של מיליליטר אחד של PBS.

רק טען כל מזרק על משאבת מזרק, ולאחר מכן חבר אותם למחט ולצינורות באמצעות מזרק צינור. הנח טיפת מים סביב בסיס צינור יציאת הכניסה והסר בזהירות את הצינור המשמש לציפוי המכשיר. הכנס בזהירות את הצינור לחלקיקים ביוטיניים ול-PBS לכל אחת מיציאות הכניסה.

לאחר מכן התחל להזריק חלקיקים ביוטיניליים בקצב זרימה של 2.5 מיקרוליטר לדקה. עקוב אחר יציאת הכניסה במיקרוסקופ בסימן הראשון של חלקיקים. התחל את הטיימר והמשך בזרימה במשך שלוש דקות.

בתום שלוש הדקות, עצור את זרימת החלקיקים הביוטיניים ובמקביל התחל את זרימת PBS בקצב זרימה של 2.5 מיקרוליטר לדקה. אפשר ל-PBS לזרום במכשיר למשך שלוש דקות כדי לשטוף חלקיקים לא קשורים. כדי להתחיל ברכישה, השתמש בפונקציית סריקת התמונה הגדולה בתוכנת ההדמיה כדי לרכוש את התמונה של המכשיר כולו, ולאחר מכן ברצף, מספר את ההסתעפויות במכשיר וצור אזור עניין מעגלי בקוטר כפול מהערוצים.

במקרה זה, הגדר את קוטר אזור העניין ל-200 מיקרון מכיוון שקוטר התעלה הוא 100 מיקרון. השתמש בפונקציית הספירה האוטומטית בתוכנת ההדמיה כדי לייצא את מספר החלקיקים בכל אזור עניין לגיליון אלקטרוני. כמו כן, השתמש בתכונת החשבון האוטומטי כדי לייצא את מספר החלקיקים במכשיר כולו.

סימולציות CFD מופעלות והתוצאות מאוחסנות במסד נתונים להמשך ניתוח. המידע הכלול בתוצאות מכיל קצבי גזירה של דפנות, שטף חלקיקים במהירות והיצמדות למכשיר. המידע כאן משמש לקביעת מספר החלקיקים הנצמדים לכל אזור עניין בהינתן קלט מוגדר של ריכוז חלקיקים.

כדי ליצור מפת הידבקות גזירה, חשב את אחוז ההדבקה כמפורט בפרוטוקול הטקסט כשלב אחרון. שרטט את מפת ההדבקה המוחלטת באמצעות הקצב העצום בכל התפצלות של הרשתות וערכי ההידבקות באחוזים. תמונה זו מציגה מכשיר SMN סינ-vivo מצופה אבידן טיפוסי לאחר קשירה של שני חלקיקים ביוטיניליים מיקרון.

שימו לב שחלקיקים מעדיפים להיצמד ליד ההתפצלות ברשת. ניתן לראות את ההסתעפויות הממוספרות ברשת ה-SMN syn vivo כאן. תמונה זו היא מפת גזירה לקיר לדוגמה שנוצרה על ידי מודל ה- CFD של המכשיר.

קצב הגזירה משתנה במכשיר ונע בין 250 שניות הפוכות ל-15 שניות הפוכות כפי שנצפה במיקרו כלי דם in vivo. שימו לב שלא ניתן להשיג את קצבי הגזירה המשתנים הללו בו זמנית בתעלות מיקרופלואידיות ליניאריות מכיוון שהם מספקים קצב גזירה קבוע לכל קצב זרימה. העלילה המוצגת כאן של ערכי קצב הגזירה בכל אחת מההסתעפויות של הרשת מגלה כי דפוסי קצב הגזירה מורכבים ולא ניתן להשיג אותם עם קשר אנליטי פשוט בניגוד לערוצי זרימה ליניאריים.

יתר על כן, קיימים התפצלויות מרובות ברשת הנופלות באותו פח שקוף. מוסיף לביטחון הסטטיסטי של הנתונים המוצגים. להלן תוצאות לדוגמה של ניתוח CFD עבור שטפי חלקיקים ברשת, המשמשים לחישוב שטפי החלקיקים בענפים ובהתפצלויות של רשת הניסוי.

מפת ההדבקה המוחלטת המחושבת מניסוי SMN יחיד של syn vivo עוקבת אחר הקשר ההפוך כפי שנצפה ממפות הידבקות טהורות שהתקבלו מניסויי ערוצים ליניאריים. עם זאת, באמצעות בדיקת SynVivo, ניסוי יחיד מאפשר יצירת מפה שקופה זו, בעוד שריצות ניסוי מרובות נרכשות מהערוצים הליניאריים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במכשירי SynVivo SMN ליצירת ההדבקה המשותפת מניסוי יחיד.

בעת ביצוע ניסוי זה, חשוב לזכור לא להכניס בועות למכשיר המיקרופלואידית SynVivo SMN לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הדלקת לחקור אינטראקציה של אנדותל לויקוציטים בשיעורים שונים בניסוי יחיד. בדור הבא של המכשירים, חוקרים יכולים לחקור הידבקות ונדידה של גלגול לויקוציטים בבדיקה אחת, דבר שאינו אפשרי כיום.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות החוקרות הידבקות של תרופות, כלי העברת תרופות ותאים כדי לחקור שאלות כגון ההשפעה הפיזיולוגית של זרימה על הדבקה של תאים, תרופות תאים וכלי תרופה.