הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא לייצר ביעילות כמויות של מיליגרם של מירן קינלין שלוש ותרבית תאי חרקים, שלא ניתן לייצר במארחי ביטוי אחרים. זה מושג על ידי טרנסקטינג COT, וקטור העברה של KINLIN שלוש יחד עם נגיף bao מהונדס באמצע ליצירת נגיף bao רקומביננטי הנושא את הגן KINLIN three. כשלב שני, הנגיף מוגבר בתוך תאי חרקים כדי לייצר כמות מספקת של נגיפים לשלבים עתידיים.

לאחר מכן, תאי החרקים נגועים כדי לייצר כמויות גדולות של חלבון קינלין 3 על מנת לאפשר לנו טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה. מתקבלות תוצאות המראות שניתן לייצר קינלין פונקציונלי שלושה בטוהר גבוה בכמויות מיליגרם על סמך ניתוח דפי SDS וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הדלקת ביטוי שלושה בחיידקים הוא שביטוי תאי חרקים נגועים בנגיף מקולרי מגדיל את תפוקת החלבון הרקומביננטי פי עשרה.

תשעת תאי ה-SF להליך זה מתורבתים ומתוחזקים בתרחיף באמצעות מדיה SF 902 בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר פניצילין ו-100 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין. ליצירת נגיף באו, יש לתרבית את התאים לטווח צפיפות של חמש כפול 10 עד חמש עד אחת כפול 10 עד שישה תאים למיליליטר. כדי להכין את תשעת תאי ה-SF לטרנספקציה, ראה בערך 10 פעמים 10 לששת התאים לבאר של צלחת תרבית רקמה סטרילית של שש בארות בשני מיליליטר של מדיית SF 902 בתוספת פניצילין וסטרפטומיצין להשאיר את תשעת תאי ה-SF למשך כ-20 דקות בטמפרטורת החדר במכסה האדים כדי להיצמד לבסיס בארות הפלסטיק וכך ליצור יצירת נגיף באלו רקומביננטי חד-שכבתי מושג על ידי העברת פלסמיד, DNA ו-BMid לתוך תרבית SF תשע חד-שכבתית.

לחברת הנוירון הפאפיני וקטור הביטוי T שלוש יש את העכבר KINLIN שלוש חברת הגנים T שלוש. תחת שליטת המקדם הנגיפי P 10 BAO מחזיק ברצפים נגיפיים מאגפים של bao כדי לאפשר רקומבינציה עם האמצע האחורי ומקודד תג C Hiss Six לטיהור במורד הזרם עבור כל טרנספקציה מייצר אחד עד שניים מיקרוגרם של MFI T מטוהר שלושה עם 0.5 מיקרוגרם של B מטוהר באמצע ו-100 מיקרוליטר של SF 902 SFM ללא אנטיביוטיקה. זהו פתרון A בצינור נפרד, לדלל שישה מיקרוליטרים של אפקט תא בשני ריאגנטים עם 100 מיקרוליטר SF 902 SFM ללא אנטיביוטיקה.

עבור כל תגובת טרנספקציה, ניתן ליצור כאן תערובת מאסטר לטיפול מופחת בנוזלים אם נדרשים טרנספקטים רבים. זהו פתרון B.מערבבים את שתי התמיסות A ו-B באמצעות כ-200 מיקרוליטר מכל אחת לכל טרנספקציה ומודגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ליצירת קומפלקסים של DNA שומנים לאחר 20 דקות, מדללים את קומפלקסי ה-DNA השומנים ב-800 מיקרוליטר לכל טרנספקציה של SF 902 SFM ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן, שאפו בזהירות את המדיה החד-שכבתית של תשעת התאים SF והעבירו בזהירות את תמיסת ה-AB ותערובת המדיה על גבי ה-SF תשע חד-שכבתי.

דגרו את התאים המועברים באינקובטור לח בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מנת ליצור סביבה לחה כדי למנוע מהתאים להתייבש. מניחים את צלחת שש הבארות בכלי פלסטיק מואר לצד מגבת נייר לחה. למחרת, הוסף מיליליטר נוסף של SF 900 ל-SFM ללא אנטיביוטיקה לכל תרבית חד-שכבתית, דגרו על תאים ב-27 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים נוספים.

לאחר חמישה ימים, קצרו את נגיף ה-bao הרקומביננטי ישירות ממדיום התרבות והעבירו אותו לצינור צנטריפוגה נקי. הבהירו כל פסולת תשעה תאים של SF על ידי צנטריפוגה ב-1000 Gs למשך חמש דקות. בהעברה בטמפרטורת החדר ניתן להניח שהנגיף, שנמצא בשמות העל המתקבלים ומסומן כ-P אחד לצינור נקי P דור אחד של וירוס בעל טיטר ויראלי צפוי של 1 כפול 10 עד 7 PFU למיליליטר.

למרות שניתן לבצע SA פלאק במידת הצורך, אחסן את מלאי הנגיף P One בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לשימוש תשעת תאי SF המשמשים להגברה של נגיף הבלו הרקומביננטי בתרחיף צריכים להיות בצפיפות של 1.4 כפול 10 לששת התאים למיליליטר והתרבית צריכה לתפוס 20 מנפח הבקבוק הכולל. לדוגמא, 50 מיליליטר בבקבוק של שני ליטר. בדרך כלל להגברה אופטימלית של נגיף ה-vao וייצור חלבון, תא ה-SF 9 צריך להיות אחיד בגודלו וכדורי.

הדביקו את תרבית תשעת התאים SF עם ציר נגיפי P אחד בריבוי זיהום או MOI של 0.1 באמצעות הנוסחה הבאה. דגרו על תרבית חרקים נגועה P One ב-27 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-100 סל"ד למשך 72 שעות. שלושה ימים לאחר מכן, קצרו את הנגיף על ידי הפרדת התאים מהמדיה על ידי צנטריפוגה ב-1000 גרם למשך חמש דקות.

בהעברה בטמפרטורת החדר, הנגיף המובהר העשיר את המדיה לצינור נקי. מלאי ויראלי זה מסומן כ-P 2 והטיטר הנגיפי הצפוי הוא פי 2 10 עד 8 PFU למיליליטר. אחסן את המלאי הנגיפי הזה בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לשימוש, שמור את כדורי התאים המתקבלים ב-20 מעלות צלזיוס שליליות לאישור מאוחר יותר של ייצור וירוס רקומביננטי.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לגדל נפח מספיק של תשעה תרביות תאים SF בתרחיף ו-SF 902 s fm. בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר פניצילין ו-100 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין. היחס בין נפח התרבות הכולל לנפח הבקבוק צריך להיות אחד עד חמש.

דגרו על תרביות ההשעיה ב-27 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-100 סל"ד עד שהן מגיעות לצפיפות תאים של פי שניים פי 10 לששת התאים למיליליטר. כאשר תשע תרביות SF נמצאות בצפיפות של פי שניים פי 10 לששת התאים למיליליטר, הן מוכנות לזיהום בנגיף הבלו. השלימו את התרביות עם ריכוז סופי של סרום בקר עוברי 1% ואחריו ציר P שני נגיפי.

כדי לתת MOI של דגירה אחת של התרביות הנגועות ב-27 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-100 סל"ד 72 שעות לאחר ההדבקה, קצור פולי היסטמין רקומביננטי מתויג לין שלושה המבטא SF תשעה תאים על ידי צנטריפוגה ב-1000 GS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. אחסן את כדור התא שהתקבל ב-20 מעלות צלזיוס שליליות עד לשימוש או במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. הליך זה מתחיל בהפשרה על קרח.

הכדורים הקפואים של נגיף ה-vao הדביקו את SF 9 המבטאים קינלין רקומביננטי שלוש ו-Resus משהה את הכדורים עם מאגר ליזה. לאחר הדגירה של התאים התלויים עם מאגר הליזיס למשך חמש עד 10 דקות, מערבולת עד להשגת תרחיף הומוגני לשיבוש תאים נוסף. סוניקציה של הדגימה באמבטיית קרח.

הבהירו את הליזאט על ידי צנטריפוגה ב-48,000 GS למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. טען את שמות העל המתקבלים על עמודת מלכודת נפח של חמישה מיליליטר מאוזנת מראש עם מאגר ליזה בארבע מעלות צלזיוס בקצב של מיליליטר אחד לדקה. השלבים הבאים להחלפת מאגר פליטת חלבון וריכוז החלבון לא יודגמו כאן אלא מפורטים בכתב היד הנלווה.

לאחר קבלת תמיסת חלבון חילופי החיץ, יש למרוח אותה על עמודת HP של הפרין בנפח 5 מיליליטר מאוזנת מראש באמצעות ACTA FPLC בקצב של 0.5 מיליליטר לדקה. ה-KINLIN 3 הקשור נרמז באמצעות שיפוע נתרן כלורי ליניארי באותו מאגר הגדל בקצב של 10 מילי-מולרי למיליליטר תגי היסטמין רקומביננטים. KINLIN 3 צפוי לפרוש בסביבות 0.6 נתרן כלורי מולארי לאחר ריכוז החלבון, השלב האחרון הוא החלפת חוצץ החלבון באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל למרוח את החלבון המטוהר על עמודה SUEx S 210 30, לטהר את החלבונים לפי גודל על ידי מריחת חיץ על העמודה בקצב של 0.5 מיליליטר לדקה.

החלבון המרמז מהעמודה מפוצל ומנוטר באמצעות הסופג ב-280 ננומטר. ההצלחה של יצירת נגיף רקומביננטי אומתה על ידי הערכת נוכחותם של תאי קינלין 3 רקומביננטיים ותאי SF 9 טרנספטציה של COT על ידי דף SDS וניתוח מערבי כפי שניתן לראות בדם המערבי המייצג הזה של שש תרביות SF תשע בקנה מידה קטן באמצעות נוגדן אנטי שש שש, פס שקוף המתאים לחלבון מתויג של 75 קילודלטון היה נראה בכל דגימה לאחר שהנגיף הוגבר ושימש להדבקה SF תשעה תאים בניסויים בקנה מידה גדול. רקומביננטי KINLIN 3 טוהר חלקית על ידי כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת.

תמונת הג'ל הראשית באיור זה מציגה את דף SDS של קינלין עכברי רקומביננטי מטוהר של ניקל שלוש מבוטא ב-SF נגוע בנגיף BAO תשעה תאים חלבון נספג נרמז באמצעות שיפוע ole המוצג מעל תמונת הג'ל. MW מציין סמן משקל מולקולרי LYS הוא כל התא ליזאט FT הוא הזרימה דרך WI היא שטיפה אחת ו-WII היא שטיפה שתיים. ניתוח כתמים מערביים בוצע גם באמצעות שברי הפליטה כדי לאשר את נוכחות התג המהונדס שלו על החלבון הרקומביננטי.

לאחר מכן, ה-KINLIN 3 המטוהר חלקית טוהר עוד יותר להומוגניות קרובה על ידי כרומטוגרפיה של חילופי יונים באמצעות עמודת הפרין. פאנל זה מציג את הפרופיל האלוסיאני שנצפה ב-280 ננומטר בכחול, ומציג שיא סימטרי יחיד החומק תחת שיפוע נתרן כלורי ליניארי המצוין בירוק, תוך שימוש בטווח ריכוז נתרן כלורי של 0.05 מולרי עד 1.0 טוחנת. הפאנל התחתון מציג את תוצאות ניתוח עמוד SDS של הפליטה המפוצלת המדגימה את נוכחותו של חלבון 75 קילודלטון קינלין שלוש.

כשלב אחרון, טוהר KINLIN 3 מלוטש על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כדי להסיר אגרגטים ולהשיג הומוגניות. פרופיל אלוציאני לסינון ג'ל מייצג זה הוא של קינלין מטוהר שלוש באמצעות SUEx S 200 ב-Tris HCL pH 7.5 150 מילי-מולרי נתרן כלורי ו-DTT מילי-מולרי אחד ב-20 מעלות צלזיוס. בהתבסס על נפח הפליטה, KINLIN 3 נודד כצפוי לחלבון של 75 קילודלטון, מה שמרמז על כך שהוא מונומרי בעיקרו.

האיור הבא מציג תוצאות מדף SDS של קינלין רקומביננטי מטוהר בריכוז גבוה שלוש המסומן K שלוש ב-14.5 מיליגרם למיליליטר. ייצור כמויות מיליגרם של קינלין 3 עכבר באורך מלא בטוהר גבוה ותרבית תאי חרקים יאפשר מחקרים מבניים נרחבים וניתוח ביוכימי של החלבון. במחקר זה בוצעה גם בדיקת הסטה תרמית מבוססת רצפה תרמית כדי לקבוע אילו מאגרים מייצבים עבור KINLIN 3.

KINLIN 3 דולל למאגרים שונים, הכוללים מסך דו-ממדי של pH לעומת ריכוז נתרן כלורי. הפאנל העליון הוא היסטוגרמה תלת מימדית של טמפרטורות המעבר והפאנל התחתון מציג את השינוי בטמפרטורת המעבר מהממוצע המחושב של 50.4 מעלות צלזיוס. הסורגים צבועים לפי טווח הטמפרטורות שאליו הם מתאימים.

KINLIN 3 נצפה יציב בריכוזי נתרן כלורי גבוהים בטווח PA של 7.0 עד 9.0 עם טמפרטורת מעבר עקבית של 55 מעלות צלזיוס. כמו כן, נצפה כי טמפרטורת המעבר של קינלין 3 הייתה כ-55 מעלות צלזיוס בטווח הרשות הפלסטינית של 7.0 עד 7.5. ללא קשר לריכוז הנתרן הכלורי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר הדלקה רקומביננטית פונקציונלית טהורה ביותר. שלושה לאפיון ביופיזיקלי מעמיק ומחקר נוסף. ניתן להשתמש בגישות דומות עם דגימות חלבון קשות להכנה אחרות, ואנו ממליצים ליישם אותן במקרים כאלה.