פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

בסרטון זה, אנו מתארים פרוצדורה יעילה מבחינת זמן ועלות לביטוי של חלבונים מופרשים מתאי HEC 2 9 3 T. ראשית, מכינים תרבית תאי HEC 2 9 3 T בנשיאות של 40% בצלחת שש באריים. לאחר מכן, מכינים תערובת טרנספקציה על ידי דילול של gene juice, ולאחר מכן של פלסמידי הבדיקה, בתווך נטול סרום.

תערובת הטרנספקציה מורססת על התאים, אשר לאחר מכן מדגגרים בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר ביטוי של חלבון. ניתן לבצע זיהוי של החלבון בנוזל העל (supernatant) באמצעות western blot. לאחר זיהוי קונסטרקט מתאים, ניתן להגדיל את קנה מידה של הפרוצדורה באמצעות מפעלי תאים (cell factories) של 10 שכבות.

התאים עוברים טרנספקציה באמצעות PEI כחומר הטרנספקציה. ניתן לאסוף את החלבון מנוזלי העל של התרבית באמצעות סינון זרימה טנגנציאלית (tangential flow filtration) ולאחריו כרומטוגרפיית זיקה (affinity chromatography). בסופו של דבר, פלטפורמה זו מאפשרת ביטוי של מגוון רחב של מקרו-מולקולות בכמויות של מיליגרמים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביטוי בתאי חרקים המבוסס על נגיפי baculovirus, הוא שניתן לסנן מספר רב של מבנים (constructs) ולהגדיל את קנה המידה של הביטוי, כאשר התוצאות מתקבלות בתוך שלושה שבועות. את הפרוצדורה הזו ידגימו שדה זיני וג'ונתן קוק, שלושה סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. התחילו בזריעה של 250,000 תאי HEC 2 9 3 T לכל באר בנפח של 1 mL בתוך פלטה של 6 בארות. הוסיפו 1 mL לכל באר של DMEM מועשר ב-10% FBS ופניסילין-סטרפטומייסין, וסובבו את הפלטה כדי לפזר את התאים באופן שווה.

לאחר מכן, דגרו את התאים למשך לילה באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. ברגע שהתאים מגיעים למסנכרנות (confluency) של כ-40%, החליפו את ה-SUP natum בשני milliliters של מצע טרי כדי להכין את תערובת הטרנספקציה. ראשית, העבירו מנה של 90 microliters של DMEM נטול סרום לשפופרת eend orph.

לאחר מכן, הוסיפו 3 µL של gene juice, ריאגנט הטרנספקציה, ערבבו בעדינות את תוכן המבחנה והדגרירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL מתמיסת מלאי בריכוז 100 ng/µL של DNA פלסמידי מטוהר שנקבח בשיטת mini prep, להעברה בטרנספקציה.

ערבבו את תכולת המבחנה והניחו לה לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי לבצע את הטרנספקציה, העבירו את התערובת על תאי HEC 2 9 3 T. טפטפו את התערובת טיפה אחר טיפה, תוך כדי ניעור עדין של הפלטה כדי להפיץ את תערובת הטרנספקציה באופן שווה.

לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר 24 שעות, הוסיפו 1 mL של מצע טרי לכל באר ודגרו למשך 48 שעות נוספות. שלושה ימים לאחר הטרנספקציה, אספו את העלייה (supernatant) וזהו את רמות הביטוי של החלבון הנחקר באמצעות western blot.

לאחר זיהוי קונסטרקט מתאים, ניתן להגדיל את קנה המידה של הליך הטרנספקציה. באמצעות מפעלי תאים של 10 שכבות, מלאו מפעל תאים ב-1.2 liters DMEM מועשר ב-5%FBS. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיליון תאי HEC 2 9 3 T, תוך חלוקה שווה של התאים לכל השכבות.

ארבעה בקבוקי תרבית תאים מסוג T 225 סמ"ר שגדלו עד ל-100% התמלאות (confluency) מכילים כ-200 מיליון תאים. דגרו את התאים ב-37 °C למשך לילה. הכינו את תערובת הטרנספקציה בבקבוק T 75 על ידי דילול של 840 µg של DNA ב-84 mL של 1x PBS סטרילי.

הוסיפו 2.5 milliliters של תמיסת polyethylene ion או PEI בריכוז של one milligram per milliliter, והדגירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. התמיסה אמורה להפוך לעכורה. לאחר מכן, שפכו באיטיות את תערובת הטרנספקציה אל תוך ה-cell factory ופזרו אותה באופן שווה.

שכבות כלליות. הוסף חומצה ולפרואית בריכוז סופי של four millimolar. פעולה זו תגדיל את תשואי הביטוי לאחר הוספת תערובת הטרנספקציה.

דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבעה ימים כדי לאפשר ביטוי של חלבונים. אספו את המצע ארבעה ימים לאחר הטרנספקציה ונקו מיד את מפעל התאים (cell factory) לצורך שימוש חוזר; סובבו את המצע שנאסף בצנטריפוגה ב-6,000 G למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, וסננו אותו באמצעות התקן סינון בוואקום עם קפסולת סטריליזציה של 0.22 micron כדי להסיר חלקיקים. לאחר מכן, השתמשו במערכת סינון זרימה טנגנציאלית (tangential flow filtration) מסוג CentraMate כדי לרכז את עליון התרבית (supernatant) ל-75 milliliters.

לאחר ריכוז הנוזל העליון (supernatant), ניתן לטהר את החלבון המבוקש באמצעות כרומטוגרפיית זיקה (affinity chromatography). בניסוי זה, טיהרנו את תתי-היחידות המצומדות ל-HA של הדומיין החוץ-תאי של קולטני AAL two אנושיים באמצעות המערכת רחבת ההיקף המתוארת כאן, ולאחריה כרומטוגרפיה עם anti THA בעלת זיקה גבוהה. כפי שמוצג בניתוח SDS page זה, שנצבע ב-kumasi.

הדומיינים החוץ-תאיים של תתי-היחידות אלפא וגמא של קולטן האינטרלוקין 2 נעים במשקלי מולקולריים של 40 kilodaltons ו-46 kilodaltons. ההטרוגניות של גליקנים מסוג EnLink הנוכחים ב-IL two R alpha וב-IL two R gamma גרמה להרחבת הפסים בגל ה-SDS page. הפס בעל המשקל המולקולרי הגבוה מייצג זיהום של BSA.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה של אופן ביטוי חלבונים מתרביות תאים אנושיים באמצעות מפעלי תאים בעלי 10 שכבות. זכרו כי תאי HC 2 93 T נחשבים לחומרים בעלי סיכון ביולוגי ויש לטפל בהם ברמת בטיחות ביולוגית 2. יש ללבוש תמיד ביגודי מגן אישיים מתאימים, ויש לחטא את המשטחים בהתאם להנחיות המוסדיות והממשלתיות.