ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לצפות בביטוי גנים חולף של מדווח מתויג GFP בתאי אפידרמיס של עלי טבק. זה מושג על ידי תכנון ראשון של מבנה DNA שיתבטא בכלורופלסט ובפרוקסיזומים. לאחר מכן המבנה נבנה באמצעות הגברת PCR והרכבת גיבסון.

לאחר מכן, נעשה שימוש באקדח גנים כדי להעביר את המבנה לתאי האפידרמיס של עלי הטבק. בסופו של דבר, הדמיה של עלה הטבק על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית חושפת ביטוי GFP בכלורופלסט ובפרוקסיזום. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיבוט קלאסי, הוא שהיא אינה דורשת אנזימי הגבלה, ולכן ניתן לשכפל כל רצף שניתן להגביר באמצעות PCR.

בגלל הגמישות של העיצוב הגנטי, היישומים של טכניקות אלה מתרחבים לקנה מידה גדול יותר. הנדסה גנטית של צמחים חקלאיים התחל פרוטוקול זה על ידי קביעת האתרים בתוך תא הצמח לביטוי החלבון הסופי. עבור עבודה זו, המטרה היא למקד את הביטוי לכלורופלסט, פרוקסיזום וציטוזול.

לאחר מכן, עצב את מבנה הביטוי. המבנה חייב להכיל מקדם, גן הניתן לזיהוי וסיום בתוך פלסמיד יחיד. במקרה זה, המקדם המכונן P end cup two מניע את הביטוי של GFP, ואחריו Nolene Synthe, terminator או nos t.

שימו לב שבניסוי זה, נבדוק סדרה של תגים, תגי טריט, אחד, שניים ושלושה מסוף קצה מבוטא ל-GFP לביטוי בכלורופלסט ופרוקסיזומים. שיטת ההרכבה של גיבסון תלויה בפעולה של מספר אנזימים בתערובת מוכנה מראש כדי לעכל חלקית את הקצוות של DNA דו-גדילי ולהקל על חישול זוגות בסיסים משלימים של רצפי DNA שכנים. למבנה הסופי יש שלושה חלקים שיש להגביר בארבע תגובות PCR לפני הרכבת גיבסון.

התגובות הראשונה והשנייה מגבירות וקטור פלסמיד של 8,000 זוגות בסיסים, PORE, המכיל GFP NOS T, וסמן התנגדות cany. סמן ההתנגדות הוא מקום טוב לחלק את ה-DNA הגדול הזה לשתי תבניות קטנות יותר המוגברות ביתר קלות PCR. התגובה השלישית מגבירה את המקדם P קצה שתיים, והתגובה הרביעית מגבירה טריאג אחד באמצעות תוכנת עיצוב סיליקון כגון עיצוב קוף, בסיס המבנה לבסיס, כך שיש חפיפה של 50 זוגות בסיסים בין כל חלק.

בהזמנת פריימרים ל-PCR, ניתן להשתמש בחפיפה של 50 זוגות בסיסים כ-25 זוגות בסיסים לכל כיוון לאחר ביצוע PCR כדי להגביר כל רכיב, יש לטהר את מוצר ה-PCR בנפרד ולדלל אותם במים מזוקקים דה-יונים. אם תבנית ה-PCR הייתה מיני הכנה מטיפול באי קולי עם אנזים הגבלה DPN, ניתן להסיר את ה-DNA של התבנית המזהמת. לאחר מכן, מדדו את הריכוזים של כל אחת מפיסות הדנ"א.

התאם את ריכוז הווקטור לכ-150 ננוגרם למיקרוליטר עבור כל מבנה להרכבה, כולל בקרה, הוצא 15 מיקרוליטר מתערובת גיבסון אסמבל מהמקפיא והפשיר אותה על קרח. שימוש בקוד פתוח מקוון tool@gibbon. org, לקבוע את הנפחים עבור כמויות שוות ערך של כל אחד מהקטעים.

הוסף את הנפח המחושב של כל אחד מהשברים לתערובת גיבסון של 15 מיקרוליטר. הכינו גם בקרה של ה-DNA הווקטורי בלבד. הנפח הכולל של כל תגובה צריך להיות 20 מיקרוליטר.

השתמש במים כדי לכוונן את עוצמת הקול במידת הצורך. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 50 עד 55 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות. לאחר הדגירה, הניחו את הצינורות בחזרה על קרח.

הסר צינור מיקרו פוגה המכיל תכשיר מסחרי של 200 מיקרוליטר סידן כלורי מוסמך אי קולי ממקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס, וחמם אותו מעט ביד. לאחר מכן הוסף את כל 20 המיקרוליטרים של התגובה לאי קולי. דגרו את התרביות על קרח למשך 30 דקות, ואז העבירו אותן לאמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס והלם חום למשך 60 שניות.

אל תשתמש בתאים מוכשרים אלקטרו. ריכוז המלח הגבוה יחסית וריכוז ה-DNA הנמוך עלולים לגרום לתאים לקשת לאחר הטרנספורמציה. החזירו את התרביות ל-ICE למשך שתי דקות, ולאחר מכן מרחו 750 מיקרוליטר של מדיום SOC או LB ואפשרו להן להתאושש במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

הצלחת הבאה, התערובת על צלחות LB עם דגירה של cany או אנטיביוטיקה מתאימה אחרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה מסננת 10 מושבות על ידי רצף. שים לב ששיטה זו עשויה לגרום לרקע גבוה יותר ולמספר גבוה יותר של אירועי רקומבינציה שאינם מטרה מאשר שיבוט מסורתי מבוסס קשירה. ההעברה הביוטית של טבק עם אקדח גנים תוארה בעבר ב-JoVE.

כאן, השלבים וההבדלים העיקריים נסקרים מהפרוטוקולים הקודמים. לאחר הגברה ובידוד של המבנים, הכינו כדורי אקדח גנים כמתואר במאמר JoVE מאת וודס וזטו והעמיסו אותם לאקדח הגנים לטרנספקציה של רקמת האפידרמיס של ניקו טניה בנהם מיאנה עלה טבק. בחר עלה גדול קרוב לבסיס של צמח בן שלושה עד חמישה חודשים.

הנח אותו בזהירות עם הצד התחתון כלפי מעלה על מגבות נייר רטובות בצלחת פטרי בגודל 15 ס"מ עם הגנה מתאימה לעיניים ולאוזניים. הגדר את לחץ ההליום עבור אקדח הגנים ל-200 עד 250 PS. אני מכוון בזהירות את אקדח הגנים בין הצלעות בצד התחתון של העלה, כשלושה עד חמישה סנטימטרים מעליו. שחרר את הבטיחות והעביר את החלקיקים לעלה.

השתמש בכל כדור פעמיים באותו מיקום על העלה. עברו למקום אחר וחזרו על התהליך אם העלה מתפוצץ, זרקו והתחילו עלה חדש. יש שונות מסוימת בקשיחות העלים עקב תנאי גידול כמו גיל, לחות וכו'.

לאחר שכל הצילומים נמסרו, כסו את העלה ואחסנו אותו יומיים-שלושה בתאורה חלשה על הספסל. בחנו את העלה במיקרוסקופ מנתח המצויד בפלואורסצנטיות UV וחפשו תאים בודדים המבטאים GFP. כאשר נמצאים תאים המבטאים GFP, השתמש במספריים לניתוח כדי לחלץ בזהירות חמישה עד 10 מילימטר של עלה.

טבלו מיד כל שבר עלה בודד בבאר של שקופית מיקרוסקופ באר עמוקה המכילה כ-200 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X 100. חומר הניקוי מסייע במניעת היווצרות בועות אוויר על פני השטח ושקופית מיקרוסקופ הבאר העמוקה מאפשרת תאי תמונה גדולים יותר של אזור הדמיית רקמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במסננים המתאימים ומטרת טבילה במים פי 40. במחקר זה, שלושת מבני המטרה השונים של GFP הושוו ל-GFP ללא תיוג ורוביס. קרישה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית GFP שימשה לאיתור פלואורסצנטיות GFP בתאים בודדים שעברו טרנזייציה בניסויי בקרה שבהם התבטא GFP לא מתויג. פלואורסצנציה נצפית בגרעין ובציטוזול בלבד, אך לא בכלורופלסט, המזוהים על ידי האוטופלואורסצנציה האדומה של כלורופיל כפי שניתן לראות בדוגמה זו של תא שהועבר עם כלורופלסט רק Rubis Oag. מבנה GFP GFP התבטא באברונים הגדולים.

התא מסומן בלבן. הצהוב מציין אזורים של קולוקליזציה של המבנה עם כלורופיל המציין שהמבנה ממוקד לכלורופלסט כפי שמוצג בתמונה זו של טריאג ביטוי GFP של תא שעבר טרנספטציה אחת נראה בכלורופלסט, היקפי, ציטוזול ואברונים מנוקבים קטנים הנחשבים לפרוקסיזומים. כמו כן, טריאג שני תאים שעברו טרנספטציה מבטאים גם GFP בציטוזול הכלורופלסט ובפרוקסיזומים טריאג שלוש, המורכב מאות פרוקסיזום המוטבע באזור מורכבות נמוכה של רצף הכלורופלסט, הממוקם רק לכלורופלסט ולפרוקסיזום.

שימו לב שתא זה נמצא בשכבת עלה אחרת. איור זה מסכם את הביטוי שנצפה בתאים של תא אפידרמיס טיפוסי של עלה טבק. הגדלים והמיקומים היחסיים בתוך התא מוצגים ורמות הביטוי היחסיות שנצפו באמצעות טרנספקציה של אקדח גנים ומיקרוסקופיה קונפוקלית.

שימו לב שה-GFP הלא מתויג מתמקם לציטוזול ולגרעין, בקרת PIMT שני GFP מתמקמת בכלורופלסט וטריאג GFP אחד, טריאג שני GFP וטריאג 3G FP הממוקם לכלורופלסט ולפרוקסיזום כצפוי, לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות פלזמה עם מכלול גיבסון, העבירו אותו לעלי טבק, וצפו בביטוי GFP תוך שלושה ימים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש ב-150 ננוגרם למיקרוליטר של DNA וקטורי עבור מכלול גיבסון, ו-1500 ננוגרם למיקרוליטר של מבנה ה-DNA הסופי שלך כדי ליצור את כדורי אקדח הגנים שלך בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טרנספקציה של אגרובקטריום כדי להשיג ביטוי גנים יציב ולא חולף.