הערכת עמילות phagocytic של מוות של תאים בשבץ ניסויי על ידי בדיקות ניאון Ligatable
27 במאי 2014
אנו מציגים טכניקה חדשה לקרינה סלקטיבית בתיוג באתרו של תאי phagocytic פעילים, אשר ברור מעל גופות תא בשבץ מוחי. הגישה היא חשובה להערכת תגובת המוח לאיסכמיה כי רק חלק קטן מphagocytes נוכח במוח איסכמי להשתתף בפינוי של מוות של תאים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג באופן סלקטיבי תאים פגוציטים פעילים, המפנים גוויות תאים בשבץ מוחי. זה מושג על ידי הכנה ראשונית של רכיבים לתגובת הגברת האות מבוססת Tite. השלב השני הוא הכנת החלקים.
לאחר מכן, תגובת התיוג מתבצעת באמצעות האנזים vaccinia, topoisomerase ובדיקות פלואורסצנטיות אחראיות. השלב האחרון הוא שיפור אות פלואורסצנטי מבוסס IDE. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת להערכת פינוי פגוציטי של תאים מתים בקטעי רקמה של איסכמיה מוקדית במוח.
פינוי תאים מתים על ידי פגוציטים ממלא תפקיד חשוב בהתאוששות המוח לאחר איסכמיה. השיטה המוצגת קובעת את היעילות של תהליך זה על ידי תיוג רק אותם גדלי פגו המסירים באופן פעיל תאים מתים. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי המוח האיסכמי, היא יכולה לשמש גם לחקר פגיעה איסכמית באיברים ורקמות אחרים.
כאשר FA פינוי חומצי של תאים מתים חשוב. למרות שהגברת אות ה-IDE או שלב ה-TSA מתרחשים בשלב הסופי של התיוג, ההכנה לתגובה זו יכולה להימשך יותר משעה. לכן נוח יותר להכין את ריאגנטים של TSA תחילה.
הצעד הראשון הוא לייצר את תמיסת מלאי הפלואורו ארבע TYROM ב-300 מיקרוליטר של DMSO לקבצי ריאגנטים של tyrom הכלולים בערכת התיוג של TSA. לאחר מכן, הכינו את מאגר הכביסה של TNT כדי להמיס לחלוטין את המגיב החוסם. כשמכינים את המאגר החוסם TNB, מוסיפים אותו לאט במרווחים קטנים תוך כדי ערבוב, מחממים את התמיסה בהדרגה ל-55 מעלות צלזיוס.
תוך ערבוב מתמשך, התמיסה תיראה חלבית ויש להביא אותה לטמפרטורת החדר לפני השימוש ב-aliquot ולאחסן בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח להליך זה, שקופיות מוכנות מבעוד מועד על ידי הרכבת קטעים בעובי של חמישה מיקרומטר. חתוך מרקמה קבועה של פורמלין. ראשית, יש לטפל בחלקים בקסילן למשך 15 דקות, להרטיב את החלקים באמצעות סדרה של שטיפות אתנול, ולאחר מכן שתי שטיפות במים.
לאחר מכן, הכינו את תמיסת העבודה של פרוטאינאז K על ידי דילול תמיסת מלאי ל-50 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS. החלק הקשה ביותר בניסוי זה הוא קביעת משך הזמן האידיאלי עבור בקרות עיכול חלבון K עם זמני עיכול קצרים וארוכים יותר כאחד כדי להבטיח הצלחה בהתאם לגודל וסוג הרקמה. הוסף את הנפח המתאים של תמיסת העבודה של חלבון ACE K לחלקים ודגירה למשך 15 דקות בחום של 23 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה יש לשטוף את החלקים במים מזוקקים פעמיים למשך חמש דקות כל אחד. בזמן שהחלקים ספוגים, הכינו את תערובת התיוג המכילה את הגשושית הפעילה. כדי להכין את תמיסת הבדיקה הפעילה, שלב את האוליגונוקלאוטידים עם מים תריס מולארי אחד, HCL והחיסון טופואיזומראז המסופק בערכה מעורבב בעדינות על ידי פיפטינג ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי לאפשר הפעלת
בדיקה.לאחר תקופת הכביסה השנייה, הוציאו את החלקים מהצנצנת ושאבו את שארית המים. כשהוא מוכן, יש למרוח את תמיסת הבדיקה הפעילה שהוכנה קודם לכן. מחליקים את החלקים ומדגרים אותם למשך 15 דקות בחום של 23 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, טבלו את המגלשות במים כדי להסיר בעדינות את החלקות הכיסוי. שטפו את המגלשות במים שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת. לאחר הכביסה האחרונה, כסו את חלקי הרקמות במאגר חוסם TNB ודגרו את השקופיות בתא לח למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
במהלך תקופה זו, הכינו דילול של 1 עד 100 של מצומדים פרוקסידאז צנון מופשט וצנון סוסים. S-A-H-R-P במאגר חסימת TNB, אחזר את השקופיות ושאף את מאגר חסימת ה-TNB. לפני מריחת תמיסת S-A-H-R-P, השתמש במספיק מגיב כדי לכסות את כל קטע הרקמה.
לאחר הכיסוי, דגרו את המגלשות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, שטפו את המגלשות שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת. במאגר כביסה של TNT בטמפרטורת החדר, הכינו דילול של 1 עד 50 של פלואורו ארבעה מלאי TY IDE במדלל הגברה אחד x מיד לפני השימוש. זרקו את התמיסה על המגלשות המכסות לחלוטין את קטע הרקמות.
מכיוון שלא ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסה, השלך את כל החלק שנותר שאינו בשימוש. דגרו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד 10 דקות. עקוב אחר הקרינה.
הגדל תחת המיקרוסקופ עד שהרמזים הראשונים למבנים נראים בשלב זה. המשך במהירות לשלב הכביסה. שטפו את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת.
ב-TNT יש לשטוף את המאגר בטמפרטורת החדר עם תסיסה. לאחר הכביסה, הוסף את התמיסה נגד דהייה עם DPI והחלקת כיסוי. צפו בתוצאות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תמונות אלה מציגות שתי דוגמאות לפינוי חומצי PHA. הכתם הגרעיני מוצג בפלואורסצנציה כחולה ובדיקת הוואק טופו האחראית מוצגת בדיאגרמות פלואורסצנטיות ירוקות של האירועים המוצגים בתמונות אלה מראות גרעינים של פגוציטים וגרעינים נוספים שנבלעו בשלבי עיכול שונים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תדעו להשתמש בבדיקות פלואורסצנטיות אחראיות בקטעי רקמות. תוכל גם לתייג באופן סלקטיבי רעיונות פעילים המנקים תאים מתים במוח איסכמי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקת פלואורסצנציה חדשנית לסימון סלקטיבי של תאי פגוציטוזה פעילים המעורבים בפינוי שאריות תאים לאחר שבץ מוחי. שיטה זו היא קריטית להבנת תגובת המוח לאיסכמיה, שכן רק חלק קטן מהפגוציטים משתתפים בתהליך פינוי זה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה
רקע
- פינוי פגוציטי של תאים מתים חיוני להחלמת המוח לאחר איסכמיה.
- רק תת-קבוצה של פגוציטים משתתפת באופן פעיל בתהליך זה.
- הבנת מנגנון זה עשויה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות.
- ניתן להחיל את השיטה המוצגת גם על איברים ורקמות אחרים.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה לסימון סלקטיבי של פגוציטים פעילים.
- הערכת היעילות של פינוי פגוציטי ברקמת מוח איסכמית.
- מתן תובנות לגבי הדינמיקה של פינוי תאים מתים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת רכיבי תגובת הגברת האות המבוססת על Tite.
- תגובת סימון באמצעות vaccinia, טופואיזומראז וגששים פלואורסצנטיים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיות של תאים מסומנים.
- אופטימיזציה של זמני עיכול ב-proteinase K עבור חתכי רקמה.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של פגוציטים פעילים ברקמת מוח איסכמית.
- הדמיה של פעילות פגוציטית באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
- הדגמת התאימות של השיטה לרקמות אחרות.
- תובנות לגבי התזמון והיעילות של פינוי פגוציטי.
מסקנות
- הטכניקה שפותחה משפרת את ההבנה של תהליכי פגוציטוזה באיסכמיה.
- היא מספקת כלי בעל ערך לחקר מנגנוני פינוי תאים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למערכות איברים שונות המושפעות מאיסכמיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות סלקטיבי של פינוי פגוציטי פעיל בשבץ ניסיוני מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולים נוירו-דלקתיים ומספק מידע לתיקוף מטרות עבור אסטרטגיות להתאוששות של ה-CNS. שיטה זו, המבוססת על גשש פלואורסצנטי ניתן לקישור, מספקת ביטחון חיזוי בהערכת היעילות של פגוציטים לניהול פסולת, ותומכת ברציפות תרגומית משלב הגילוי למחקר פרה-קליני. יכולתה להבחין בין פגוציטים פעילים לבלתי פעילים משפרת את קבלת ההחלטות לגבי תיקי תוכניות טיפוליות נוירו-פרוטקטיביות ורגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני פינוי פגוציטיים ברקמת מוח רלוונטית למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הבחנה בין פגוציטים פעילים לבין תאים שאינם מעורבים בתהליך (bystanders).
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים במסלולים נוירו-דלקתיים ורגנרטיביים.
- מספק נתונים כמותיים לביטחון חיזוי בתוכניות CNS בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מכין חתכי רקמה שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של דימוי כמותי בהמשך.
- מנstandardize (מתקנן) את זיהוי אירועי פגוציטוזה פעילים לצורך קבלת תוצאות בדיקה הדירות.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה (scalable) של מודולטורים המשפיעים על יעילות הפינוי הפגוציטרי.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על פינוי תאי מוות in situ.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה של פגיעה איסכמית לצורך פיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים.
- מספק רצף מגילוי מנגנוני ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות להתאוששות של ה-CNS.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מועמדים לנוירופרוטקציה ורגנרציה בהתאם לסיכונים.
- מציע הפחתת סיכונים חזויה עבור ליאביליות ביולוגיות בשלבים מאוחרים הקשורות לכשל בפינוי תאים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של פינוי פגוציטוטית במודלים של איסכמיה במוח, ובכך היא תומכת הן בתיקוף של מטרות טיפוליות והן בהלימה של ביומרקרים תרגומיים.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בבדיקת השערות לגבי פינוי המתווך על ידי פגוציטים והבהרת מסלולים ברקע של רקמה איסכמית.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של אירועי פגוציטוזה פעילים לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מספק מדידות מבוססות פלואורסצנציה להשוואת יעילות הפינוי בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים למודלים פרה-קליניים הרלוונטיים לפגיעה והחלמה במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לחקר פינוי פגוציטי בהקשרים מגוונים של רקמות ומחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של כימות פינוי פגוציטי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go ויעילות הון על ידי הבהרת הסיכון הביולוגי בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תוכניות נוירו-דלקתיות וregenerative.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית פלואורסצנציה ובהכנת חתכי רקמה.
- דורש גישה לריאגנטים ייעודיים, כולל גששים פלואורסצנטיים הניתנים לקישור וערכות אנזימים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הסימון והדימיג לצורך הדירות.
- ניתן להתאמה לסוגי רקמות שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה של שלבי העיכול והסימון.
- תלוי בבקרה מדויקת של תגובות אנזימטיות ופרמטרי דימיג לקבלת תוצאות כמותיות.
