להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic In vivo שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay
18 באוקטובר 2016
phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את התפקוד הפגוציטי של מיקרוגליה ברשתית in vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת העיניים, כגון האם תרכובות מסוימות משנות את תפקוד המיקרוגליה הפגוציטי בסביבה פיזיולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בציטומטריית זרימה, המאפשרת ניתוח כמותי מהיר ומדויק של פגוציטוזיס מיקרוגליה.
מי שיעזור לי להדגים את ההליך יהיה סוסומו סאקימוטו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחל בהעמסת מחט ומזרק בגודל 33 עם 0.5 מיקרוליטר של תמיסת חלקיקים עם תווית פלואורסצנטית. לאחר מכן הניחו עכבר מורדם הצידה על חומר רך תחת מיקרוסקופ כירורגי ואשרו את רמת ההרגעה המתאימה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להפעיל לחץ בזהירות סביב עפעף אחד, כך שכדור העין יצא מעט מהשקע. לאחר מכן תפסו את הראש בשתי אצבעות ממש מעל האוזן ובלסת של החיה, ומתחו בעדינות את העור במקביל לעפעפיים כדי לשמור על העין בולטת מעט מחוץ לארובה. הזרקות תוך זגוגיות הן מאתגרות, ואם לא יבוצעו כהלכה יובילו לתוצאות מוטות ומשתנות.
כדי להפחית טראומה לעין, החזק את החיה במצב יציב עם תנועת ראש מינימלית. כדי לנקב את גלגל העין, אחוז בעדינות בעכבר ביד אחת. לאחר מכן אתר את לימבוס הקרנית במקום שבו הקרנית והסקלרה מתחברות, הנראה כעיגול אפור בעכברים פיגמנטיים.
החזק את המזרק ביד השנייה, הכנס את המחט ללימבוס. לאחר מכן משוך מעט את המחט כדי להוציא נפח קטן של נוזל הזגוגית, ולחץ לאט על הבוכנה כדי להזריק את החלקיקים. לאחר שכל החרוזים נמסרו, יש למשוך לאט את המזרק כדי למנוע ריפלוקס של החומר המוזרק ולמרוח טיפות לחות כדי לשמור על לחות העין לאחר שהעין נסוגה בחזרה למקומה.
לאחר מכן הניחו את החיה על כרית חימום בכלוב משלה עם ניטור עד להתאוששות מלאה. שלוש שעות לאחר הזרקה תוך זגוגית, השתמש במלקחיים בזווית של 45 מעלות כדי ללחוץ בעדינות על העפעף כדי לחזק את גלגל העין. מקם את המלקחיים מאחורי גלגל העין ומשוך.
לאחר מכן העבירו את גלגל העין לאזור היבש של צלחת פטרי, המכילה נפח קטן של PBS עם סידן ומגנזיום תחת מיקרוסקופ מנתח. והשתמש בקצה אחד של מלקחיים עדינים במיוחד כדי לנקב את העין בלימבוס הקרנית. לאחר מכן, החזיקו את גלגל העין עם מלקחיים עדינים בזווית של 45 מעלות, השתמשו במספריים קפיציים כדי לחתוך סביב לימבוס הקרנית עד לחיתוך של כמחצית מההיקף.
העבירו את גלגל העין ל-PBS והשתמשו בזוג שני של מלקחיים עדינים בזווית של 45 מעלות כדי לקרוע את הקרנית והסקלרה. העדשה והרשתית ייצאו שלמים. יש לוודא שהעדשה והרשתית מופרדות ולהעביר את הרשתית למבחנה מפוליסטירן בנפח 5.4 מיליליטר, המכילה שני מיליליטר PBS עם סידן ומגנזיום.
כדי להשיג תרחיף תא בודד של תאי הרשתית, השתמש בערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות על פי הוראות היצרן והשהה מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעה. לאחר מכן העבירו את הדגימה לבאר אחת של צלחת תחתית U של 96 בארות. לאחר הצנטריפוגה, הפוך את הצלחת כדי להשליך את הסופרנטנט ולחסום את קולטני ה-FC עם 25 מיקרוליטר של מאגר כתמים המכיל נוגדן CD16, CD32 לבאר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן סמנו את התאים עם הנוגדנים המעניינים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן גלולה את התאים ולאחר מכן שטיפה של 200 מיקרוליטר של מאגר צביעה טרי לכל באר. כעת השעו את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מאגר כתמים וצבע כדאיות והעבירו את הדגימות לצינורות מיקרוטיטר של 1.2 מיליליטר.
לאחר מכן שטפו את הבארות עם 100 מיקרוליטר נוספים של מאגר מכתים וצבע כדאיות ואגרפו את השטיפות עם הדגימות המתאימות לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. ניתן להשתמש בשיטה זו בעכברים בוגרים בני 10 עד 20 יום לאחר הלידה או וניתן להתאים אותה לבדיקת ההשפעה של תרכובות ו/או מניפולציה גנטית של פגוציטוזיס מיקרוגליאלית. לדוגמה, בניסוי זה לאחר אתגר תוך-צפקי עם מינונים משתנים של LPS, נקבע מינון של 1.42 מיליגרם לק"ג של LPS כגורם לעלייה מובהקת סטטיסטית באחוז המיקרוגליה הפגוציטית, בהשוואה לבקרות מאותגרות ברכב.
לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו מיון תאים ואחריו qPCR או ניתוח פרוטאומי, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ההבדלים בין מיקרוגליה פגוציטית ולא פגוציטית ברשתית. בפיתוח טכניקה זו, אנו מצפים שנוכל כעת לאפשר למדעני ראייה ומוח להמשיך לחקור את התפקוד הפגוציטי של מיקרוגליה באתרו ובהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה חדשנית להערכת התפקוד הפגוציטי של מיקרוגליה ברשתית in vivo. באמצעות שימוש בציטומטריה של זרימה, חוקרים יכולים להשיג ניתוח כמותי מהיר ומדויק של פגוציטוזה של מיקרוגליה, דבר החיוני להבנת ההומיאוסטזיס והפתולוגיה של הרקמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- Ofthelmology
- ביולוגיה של התא
רקע
- בליעה של מיקרוגליה חיונית לשמירה על הומאוסטזיס של רקמות.
- תפקוד בליעה לקוי מקושר לפתולוגיות שונות.
- הערכת התפקוד של מיקרוגליה in vivo מציבה אתגרים טכניים.
- ציטומטריה זרימה מציעה שיטה חסונה לניתוח.
מטרת המחקר
- להערכת התפקוד הפגוציטרי של מיקרוגליה רשטיתית בתנאים פיזיולוגיים.
- לקביעת ההשפעה של תרכובות ספציפיות על פגוציטוזה של מיקרוגליה.
- לספק שיטה מהימנה למחקרים עתידיים באופתלמולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טעינת מחט מדד 33 עם תמיסת חלקיקים המסומנים פלואורסצנטית.
- שימוש במיקרוסקופ כירורגי לצפייה מדויקת.
- ניטור העכבר המורדם להבטחת סדציה תקינה.
- שימוש בציטומטריית זרימה לניתוח כמותי.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת מדידה מדויקת של פגוציטוזה של מיקרוגליה.
- ציטומטריית זרימה מספקת תוצאות מהירות בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- ניתן להעריך השפעות פוטנציאליות של תרכובות על התפקוד הפגוציטי.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של תפקידי המיקרוגליה בבריאות ובמחלה.
מסקנות
- הטכניקה שפותחה מהווה התקדמות משמעותית לחקר התפקוד של המיקרוגליה.
- היא פותחת נתיבים חדשים למחקר בנושאי דלקת עצבית ובריאות הרשתית.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בשיטה זו כדי לבחון התערבויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
הערכה כמותית של תפקוד הפגוציטוזה של מיקרוגליה ברשתית באמצעות ציטומטריה זרימה נותנת מענה לפער קריטי בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור פייפליינים של מחלות נוירו-דלקתיות ונוירו-דגנרטיביות. גישה זו מאפשרת מדידה מדויקת וניתנת לשחזור של פעילות מיקרוגליאלית בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובמחקרים תרגומיים. יכולת ההתאמה והמהירות של השיטה מקלות על הערכה חסונה של תרכובות ועל מיון תיקי פיתוח עבור תוכניות במערכת העצבים המרכזית ובאופתלמולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של תפקוד הפגוציטוזה של מיקרוגליה in vivo לצורך תיקוף מטרה.
- תומך בהורדת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות תגובות תפקודיות להפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- מסייע בביסוס ביטחון ניבוי במודלים של מחלות CNS ורשתית על ידי אספקת מדדים כמותיים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות מיקרוגליאליות מתוהקות ובעלות רלוונטיות פיזיולוגית לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- מספק מדידות פגוציטוזה סטנדרטיות, הניתנות לשחזור וכמותיות באמצעות ציטומטריית זרימה.
- מאפשר הערכה מהירה של השפעות תרכובות על תפקוד המיקרוגליה, ובכך תומך בזרימות עבודה של סריקה ניתנות להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם מודלים הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים בניוון עצבי ובהפרעות ברשתית.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור ביצוע בדיקות תפקודיות in vivo.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על נתונים כמותיים של פעילות מיקרוגליאלית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקה זו, המבוססת על ציטומטריה של זרימה, משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קלני, ומאפשרת בדיקת השערות, סריקת תרכובות ומחקר תרגומי במסלולי פיתוח בתחומי מערכת העצבים המרכזית (CNS) ואופתלמולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: מכמתה פגוציטוזה של מיקרוגליה כדי להבהיר את תפקוד המסלול ולהפחית סיכונים בהיפותזות ביולוגיות.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור להערכת תרכובות במערכות validated in vivo.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות חסונות סטטיסטית להשוואת תנאים ניסיוניים והשפעות של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי למחקרים פרה-קליניים על ידי אפשור התאמה של ביומרקרים פונקציונליים במודלים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה רב-פעמית הניתנת להתאמה ליישומים שונים במחקר על מערכת העצבים המרכזית (CNS) והרשתית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליך תיקוף מטרות של מיקרוגליה.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות פגוציטוזה סטנדרטיות, מהירות וניתנות להרחבה לשימוש בין צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים פונקציונליים חסונים בשלב מוקדם של הpipeline.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודף וקידום של נכסי CNS ואופתלמולוגיה מותאמים לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרוצדורות עיניות במכרסמים ובניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה.
- דורש גישה למיקרוסקופים כירורגיים, לציטומטרים של זרימה ולפאנלים מאושרים של נוגדנים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ההזרקה והניתוח לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה לגילאים שונים של מכרסמים וייתכן שגם לרקמות אחרות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בטכניקה מדויקת של הזרקה תוך-זגגית (intravitreal) כדי למזער שונות והטיה.
