ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור דינמיקת שעתוק וגרעיני מוח מוגדרים של עכברים בעקבות התנסות התנהגותית. זה מושג על ידי הרגלת בעלי החיים תחילה ורישום הפעילות התנועתית שלהם לאחר הזרקת מי מלח. לאחר ההתרגלות, פעילות תנועתית נרשמת לאחר מנה אחת של קוקאין, דגימות מגרעין האקומבנס נאספות ומשמשות לבידוד RNA והכנת CDNA.

ניתוח QPCR הבא מבוצע על מנת לחקור ביטוי גנים המושרה על ידי התנהגות. בסופו של דבר, מתקבלות תוצאות המראות דינמיקת שעתוק בעקבות ניסיון בקוקאין מדגימים את הפרוטוקול ד"ר האטו, מנהל המעבדה, דום מואר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה ודוראן סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה במשך שלושה ימים רצופים. כל עכבר מורגל לתהליכי הטיפול וההזרקה, מסדר עכברים בכלובים לפני תחילת הניסוי, כך שעכברים לא יועברו בעתיד בין כלובים ועכברים לעולם לא יישארו בבידוד לתקופה ממושכת.

30 דקות לפני תחילת הבדיקה, יש להעביר את כל כלובי הבדיקה לחדר ההתנהגות כדי לאפשר לבעלי החיים להתאקלם בסביבה. יש לתת זריקה תוך-צפקית של 250 מיקרוליטר מי מלח מיד לאחר ההזרקה, למקם את העכבר בתא התנהגות כדי לעקוב אחר הפעילות התנועתית למשך 15 דקות. ניתן היה למקם את העכבר בתא ההתנהגות למשך 20 דקות.

פעילות המנוטרת מהדקה השנייה עד 17. חזור על שלבים אלה באותה שעה ביום במשך היומיים הבאים. ביום הרביעי, תנו זריקה אחת של קוקאין או מי מלח, בהתאם לקבוצה, והניחו מיד את העכבר בתא כדי לנטר את הפעילות המוטורית המקומית במשך 20 דקות בנקודות זמן נבחרות לאחר החשיפה לקוקאין, לחלץ את המוח ולהניח אותו בקור כקרח, תמיסת CSF למשך דקה עד שתיים להתקרר ולהתקשות.

לאחר הסרת המוח הקטן ונידוף עודפי נוזלים, הדביקו את המוח לשלב הרטט כשהחלק הרוסטרלי פונה כלפי מעלה. מלאו את החדר ב-CSF קר כקרח ופרסו חלקים של 200 מיקרון עד לזיהוי ברור של גרעין האקומבנס. שימו לב היטב לצורת הקורפוס קלוסום, למיקום וצורת הקומיסורה הקדמית ולחדרים בזמן החיתוך.

לאחר זיהוי האזור הנכון, פורסים שני חלקים של 400 מיקרון שמהם ינותח גרעין האקומבנס תחת סטריאוסקופ. השתמש בלהב עדין כדי לנתח את גרעין האקומבנס הרחק מהפרוסות. ארבעה מעברים מהירים של הלהב באזור הנכון אמורים לבודד את הרקמה המתאימה באופן מיידי.

מניחים את הרקמה המבודדת ב-900 מיקרוליטר של מגיב ליזה, ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד למיצוי RNA כדי להתחיל להפשיר את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס ולהומוגניזציה. באמצעות מחט בקוטר 25, הסיבובים הראשונים עשויים להיות קשים ודורשים דחיפת הרקמה כנגד דופן הצינור כדי להפוך אותה להומוגניזציה לחתיכות קטנות. כדי להבטיח הומוגניזציה נכונה, פיפטה את הליזאט על מגרסת קאיה, מיני עמוד ספין וצנטריפוגה.

הכניסו את הליזאט לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה חדש וחלצו את ה-RNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר טיהור RNA מתבצע שעתוק הפוך ל-CDNA וכן הגברה ספציפית של הדגימות עם פריימרים המכוונים כנגד קבוצת הגנים שנבחרו לניתוח. נהלים אלה מתוארים בגירסת הטקסט של הפרוטוקול.

שבבים מיקרופלואידיים מסחריים לניתוח QPCR מקיף זמינים ב-48 על 48. פורמט, המאפשר ניתוח של 48 דגימות עם 48 ערכות בדיקות, או בפורמט של 96 על 96 שבו 96 דגימות מנותחות עם 96 בדיקות. ברוב המקרים, בחירת השבב תלויה בעיקר במספר הדגימות שנותחו.

ראשית, הכינו את תערובת הדגימה בהתאם לשבב שנבחר לניסוי. היזהר בעת פיפטינג של 20 XDNA צבע מחייב טעינת דגימה. מערבבים את תמיסות תערובת הדגימה למשך 20 שניות לפחות וצנטריפוגה למשך 30 שניות לפחות.

ניתן לאחסן תגובות מוכנות לפרקי זמן קצרים בארבע מעלות צלזיוס עד שהשבב מוכן לטעינה. לאחר מכן, הכינו את תערובת הבדיקה, ערבבו היטב את תערובת הדגימה וצנטריפוגה כדי לסובב את כל הרכיבים. כפי שהוצג קודם לכן, לשבב IFC של המערך הדינמי יש כניסות לדגימות ובדיקות, כמו גם כניסות מוגדרות לנוזל קו בקרה המשמש להפעלת לחץ על התאים המיקרופלואידיים.

ראשית, הזריק נוזל קו בקרה לכל מצבר על השבב. לאחר מכן, הכניסו את השבב על ידי הכנסתו לבקר IFC והפעלת הסקריפט המתאים. בסיום התסריט, הסר את השבב הדרוך מבקר ה-IFC ופיפטה חמישה מיקרוליטר מכל בדיקה.

מערבבים על הצ'יפס. הוסף חמישה מיקרוליטר מכל תערובת דגימה לכניסות שלהם והחזיר את השבב לבקר IFC באמצעות תוכנת בקר IFC. הפעל את הסקריפט כדי לטעון את הדגימות והבדיקות לתוך השבב.

לאחר סיום סקריפט תערובת העומס, הסר את השבב הטעון מבקר ה-IFC. לאחר מכן, טען את השבב על המחזור התרמי וצור ריצת שבב חדשה הכוללת ניתוח עקומת התכה. שימוש בתוכנת המחזור התרמי מבטיח שתאי התגובה מזוהים כראוי ומאפשרים לתגובה לפעול עד לסיום.

עלייה בפעילות התנועתית ניכרה לאחר זריקת קוקאין חריפה אחת. בחתך עטרה זה, קווים לבנים עבים סימנו את מיקום החתכים שנעשו כדי להגדיר את גבולות גרעין האקומבנס. במהלך הדיסקציה, עקומות ההגברה של פריימרים המכוונות כנגד CFOs ו-phos B מדגימות שזוגות הפריימרים מגבירים את תעתיק היעד שלהם ביעילות של כ-100%.

בכל מחזור, התוצאות מראות כי הביטוי המושרה על ידי קוקאין של CFOs ו-phos B בגרעין האקומבנס היה הגבוה ביותר שעה ושעתיים לאחר החשיפה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף הדור הבא על מנת לזהות תעתיק לא מאופיין חדש.