פרוטוקול Microarray רקמות הדור הבא (ngTMA) לביומרקר לימודים

מטרת ההליך הבא היא לבנות מיקרו-מערכי רקמות אופטימליים או ממוקדים לשימוש לאחר מכן במחקר סמנים ביולוגיים. ראשית, ארכיון שקופיות דיגיטלי נוצר משקופיות רקמה מייצגות. תחומי עניין היסטולוגיים מופיעים בשקופיות הדיגיטליות כדי לציין את האזורים המדויקים של גושי התורמים המתאימים שיועברו לבלוק המיקרו-קרני של הרקמה.

לאחר יצירת העיצוב והפריסה של מיקרו-מערך הרקמות, בלוקי התורמים מנוקבים אוטומטית והסיבה נטענת למיקרו-מערכי הרקמות. באמצעות גישה מדויקת, מהירה ואוטומטית זו של הדור הבא, ניתן ללכוד במדויק אזורים היסטולוגיים מדויקים או אפילו קבוצות מסוימות של תאים ולהעביר אותם למיקרו-מערך רקמות. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו על פני השיטות הקיימות של מיקרו טבעת רקמות, כגון שימוש במכשיר ביתי או אוטומטי למחצה, הוא ללא ספק הדיוק ההיסטולוגי.

זה מושג על ידי שילוב החוזקות של פתולוגיה דיגיטלית עם מומחיות היסטולוגית וגם טבעת מיקרו רקמות אוטומטית המדגימה את ההליך כיום הם קאלין המן וחוזה גלוואן. שני סיוע טכני מהמעבדה שלנו באמצעות תוכנת הסריקה. תחילה בחר מצב אוטומטי לסריקת שדה בהיר.

לאחר מכן לחץ על אפשרויות סריקה כדי להתאים את פרמטרי איכות השקופית. כעת בחר לשמור את סריקות השקופיות באופן מקומי או לסיום האינטרנט על ידי לחיצה על פרמטרי השרת והגדר את יעד הסריקה למרכז המקרה. כעת, הכן את השקופיות לפני טעינת השקופיות למגזין עבור הסורק, בדוק שהשקופיות נקיות.

במידת הצורך, נקה אותם עם אתנול, ניתן לטעון עד 25 שקופיות בכל מחסנית וניתן לטעון את הסורק עם עד 10 מחסניות. מחסניות מרובות נערמות כאשר הן נטענות. לאחר טעינת השקופיות, תן את כל השקופיות, שמות הקבצים והגדר את תיקיית השמירה במרכז המקרה.

כעת התחל לסרוק את השקופית על ידי לחיצה על החץ הירוק. בחלק זה, המיקומים שמהם מנוקבות דגימות רקמה בשקופית נקבעים על ידי הערות לשקופית הדיגיטלית. התחל בפתיחת תיקיית השקופיות הדיגיטליות.

בתוכנת הצפייה ניתן לבצע שינויים בתיקיה עצמה. ניתן להוסיף הערות, לסדר מחדש את השקופיות, להגדיר הרשאות משתמש כמו גם קבצים מצורפים. כעת התחל להוסיף ביאורים לשקופיות על ידי לחיצה על אחת.

הוא יופיע במציג. במציג. השתמש בכלי ההגדלה כדי להעריך את השקופית ולמצוא את תחומי העניין לשילוב בדור הבא של TMA.

באמצעות כלי הביאור TMA, בחר את גודל הליבה הרצויה ואת צבע הביאור. צרף הערה זו לשקופית על ידי לחיצה על השקופית. לאחר מכן העבר את ההערה למבנים ההיסטולוגיים הרצויים.

הערות אלו מסמנות את מיקומי האגרוף על גוש הרקמה המתאים. חזור/י על תהליך זה עד להוספת הערות לכל השקופיות. אפשרות חלופית לגורם הרקמה היא לשלוח אותם לצינור PCR של 0.2 מיליליטר לניתוח מולקולרי.

הוסף הערות לשקופיות באמצעות סימן צבע שונה כדי להבחין בין כתמים אלה לאלה שהם TMA. לאחר ביצוע כל הביאורים, שמור קובץ גיליון אלקטרוני המכיל רשימה של כל השקופיות עם ההערות המתאימות וצבעי הביאור. התחל את שחזור המיקרו של הרקמה על ידי אחזור גושי רקמת הפרפין המתאימים עבור כל השקופיות הדיגיטליות המבוארות, מכאן ואילך.

נקרא בלוקים תורמים. מיין את הבלוקים באותו סדר כמו השקופיות הדיגיטליות. בדוק שכל בלוק בעובי של ארבעה מילימטרים לפחות.

אם לא, יהיה צורך להמציא מחדש את הרקמה במחשב. פתח את מיקרו-מערך הרקמות של התוכנה וספק שם לפרויקט. עבור להחלפת הכלי ובחר את קוטר הכלי הנדרש.

כעת טען עד 12 בלוקים של נמענים למחשב. שימו לב לשמות הבלוקים. יש לתייג את כולם באמצעות אותה מערכת מספור לעקביות.

לאחר מכן בתוכנה, הקצה את השם המתאים לכל אחד מהבלוקים כדי ליצור פריסת TMA. ראשית, צור עיצוב TMA חדש על ידי הקצאת מספר השורות, העמודות, השורות הריקות והמרווח בין האגרופים. שמור את הפריסה והקצה אותה לבלוק.

לאחר מכן חזור על התהליך עבור הבלוק הבא. עם פריסה חדשה או אותה פריסה, ניתן לשנות את גדלי הליבה בין בלוקים של נמענים. לאחר מכן, טען עד 60 בלוקים של תורמים למכונה.

עד 10 בלוקים נכנסים לכל שורה. בלוקים של תורמים שנותרו עד F ייטענו מאוחר יותר בתוכנה. תנו לכל בלוק תורם שם מזהה.

תמונה של כל בלוק תתרכש באופן אוטומטי. כעת יישר את השקופיות הדיגיטליות עם בלוקי התורמים המתאימים להן. ראשית, בוחרים בלוק.

לאחר מכן לחץ על השקופית והשווה את השקופית ותמונות החסימה זו לצד זו. בחר נקודות התייחסות בתמונת בלוק התורם התואמות לנקודות ספציפיות בשקופית הדיגיטלית המתאימה. לאחר מכן לחץ על הבא והביאורים יעברו לתמונה של בלוק התורם.

אם הביאורים נכונים, לחץ על כל אחד מהם כדי לאשר את מיקומו. לאחר מכן לחץ על התחל. זה מבקש מהמיקרו-מערך לקדוח חור בנקודת הייחוס בבלוק המקבל, ולאחר מכן לנקב חור מבלוק התורם באותו מיקום ולהעביר את הליבה לבלוק המקבל.

כדי לאסוף ליבות לצינור PCR, לחץ על כלי ה-PCR עבור הבלוק. ניתן להשתמש בעד ארבע הערות כדי לספק רקמה לצינור. לאחר הגדרתם, לחץ על התחל והתורם יתקשר והצינור יטען.

לאחר שהמכונה מקדחת ומנקבת, ליבות, עדכן את התמונה של בלוק התורם. המשך בחזרה על היישור וההערות עבור הבלוק הבא. ואז ליבת זה.

המשיכו לעשות זאת עבור כל בלוק תורם. זה יהיה ב-TMA. לאחר השלמת הסט הראשון של 60 בלוקים תורמים, פרקו אותם וטענו ב-60 בלוקים נוספים.

המשך בתהליך עד שכל הבלוקים התורמים מסודרים. לאחר לקיחת כ -500 ליבות, נקה את המקדחה וכלי הניקוב ישתמש. לאחר השלמת המערכים, ייצא את הפרויקט.

קובץ גיליון אלקטרוני עם נתוני הפרויקט יהיה בתיקיית הייצוא. הוא מראה את המיקום של כל דגימה בתוך כל בלוק TMA. לאחר מכן שמור את תמונות בלוק התורמים עם הערות מונחות כקבצי JPEG בתיקיית הייצוא.

פעולה זו משלימה את התהליך ליצירת בלוק TMA. פריסת TMA זו מציגה שישה בלוקים של NG TMA שנבנו בשני עותקים עבור 12 בלוקים סופיים כדי למלא את המערך. כל בלוק גידול הכיל 402 כתמי רקמה וכל בלוק רקמה רגיל הכיל 268 נקודות.

לאחר ש-60 בלוקים של תורמים הוסברו, המטרה נוקבה. זמן העברת הליבה היה כ-12 שניות. אובדן הליבה היה מינימלי, והזמן הכולל למערך, פרויקט זה היה בסך הכל כ-24 שעות.

זה כלל זמן שלקח לנקב את הסיבה לניתוח מולקולרי לאחר התהליך של N-G-T-M-A. ניתן ליישם שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה בהכלאת ציטו ואפילו כתמים מיוחדים על מיקרו-מערכי רקמות אלה על מנת לענות על כמה שאלות כגון אילו גנים או חלבונים מתבטאים או אפילו משתנים ברקמות שונות.