שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin
22 באוקטובר 2014
לאחר אקסוציטוזיס, קרום הפלזמה המאוחה מאוחזר בתהליך המכונה אנדוציטוזיס. מנגנון זה מתקן שלפוחיות סינפטיות חדשות לסבב השחרור הבא. אירועים אנדוציטיים בודדים נלכדים ומנותחים באמצעות הקלטות הקיבול המחוברות לתאים בתאי כרומפין יותרת הכליה של העכבר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שלפוחית בודדת, ציטוזיס ואנדוציטוזיס. זה מושג על ידי השגת עיכול נקי ומלא של רקמת בלוטת יותרת הכליה של העכבר. השלב השני הוא ניתוק וצלחת תאים מבלוטת יותרת הכליה.
לאחר מכן מזוהים תאי כרומין ומהדקים טלאי כדי להשיג רישומי קיבול מחוברים לתאים. בסופו של דבר, ניתן להבחין בשלפוחית בודדת, ציטוזיס ואנדוציטוזיס. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון הקלטות מחוברות לתאים של תעלות יונים בודדות, הוא שאנו מסוגלים לזהות אקסוציטוזיס ואנדוציטוזיס של שלפוחיות בודדות.
הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שקשה ללמוד להשיג חותם ג'יגה. כמו כן, זה יכול להיות קשה לזהות תאים בין סוגי תאים מעורבים שנמצאים בתוך הצלחת. כדי להתכונן לניתוח התחל בחיטוי זוג דיסקציה גדולה וקטנה, מספריים ושני זוגות מלקחיים.
לאחר מכן הניחו את מגש החיתוך על דלי קרח. התחל גם לבעבע את תמיסת האנזים עם 5% פחמן דו חמצני ו -95% חמצן. התמיסה בצבע ורוד בוהק לפני הבעבוע. הבא.
לאחר המתת חסד ועריפת ראשו של עכבר בן שלושה ימים, השתמש בסט המספריים הקטן יותר כדי לחתוך את גב הגור העוקב אחר עמוד השדרה מאזור צוואר הרחם לאזור הלב. הקפידו לחתוך באופן שטחי מתחת לעור כדי למנוע פירסינג בחלל הגוף. לאחר מכן, קלף את העור מעמוד השדרה כך שהשרירים ייחשפו ותהיה תצוגה ברורה של עמוד השדרה.
כעת בצע חתך חתך בחוט השדרה הצווארי ולאחר מכן בצע שני חתכים מקבילים לאורך צידי עמוד השדרה עם זוג מלקחיים אחד המחזיק את הגוף העיקרי של החיה. השתמש בזוג המלקחיים השני כדי לתפוס את עמוד השדרה ולקלף את עמוד השדרה לאחור עד שהכליות נחשפות. לאחר איתור בלוטות יותרת הכליה על גבי הכליות, השתמש במלקחיים כדי להסיר אותן.
לאחר מכן הניחו בזהירות את בלוטות יותרת הכליה לתוך צינור חרוטי מלא בתמיסת נעילה. השתמש בזוג מלקחיים שני כדי לעקור את בלוטות יותרת הכליה. אם הם נדבקים לזוג המלקחיים הראשון, הניחו את הצינור החרוטי על הקרח.
ניתן לשמור את הבלוטות בתמיסת נעילה עד שעתיים. בשלב זה, בדוק את תמיסת האנזים כדי לוודא שהתמיסה המאוזנת הפכה מצבע ורוד בוהק לצבע כתום ורדרד. לאחר מכן, הוסף פפה לתמיסת האנזים המבעבעת הטרייה בריכוז סופי של 20 עד 25 יחידות למיליליטר.
לאחר מכן הוסף את תמיסת אנזים הפרופאן לצינור חרוטי חדש והשתמש במלקחיים כדי להעביר את בלוטות יותרת הכליה לצינור האנזים פרופאן. דגרו על הבלוטות במשך 40 עד 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו 75% מתמיסת האינאקטיבציה לכל צינור ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות.
לאחר 10 דקות, העבירו בעדינות את הבלוטות לצינור חדש שסומן ושטפו את הבלוטות שלוש פעמים במצע תרבית. לאחר הכביסה, הנח את הבלוטות לתוך 200 מיקרוליטר של אמצעי התרבית, ולאחר מכן טיטר בעדינות את הבלוטות למעלה ולמטה דרך קצה הפיפטה של פיפטה של 200 מיקרוליטר. בעת טיטרציה, שמור על הבלוטות בתחתית הצינור בכוח כלפי מטה מקצה הפיפטה של 200 מיקרוליטר והפעל את הרקמה בעדינות ולאט הקפד להשתמש במשיכות איטיות ומתמשכות, לעולם אל תבצע פיפטינג מהיר או פתאומי לאחר טיטרציה, הוסף עוד 250 מיקרוליטר של אמצעי תרבית כדי להביא את הנפח הכולל של אמצעי התרבות עד 450 מיקרוליטר.
במקום הבא, שבע החלקות כיסוי מצופות מראש PDL בגודל 12 מילימטר בצלחת צלחת תרבית בגודל 60 על 50 מילימטר. לאחר מכן צלחו 60 מיקרוליטר מהתא המכיל תמיסה על כל אחת משבע החלקות הכיסוי. לאחר הציפוי, מניחים את המנה בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, הוסיפו בעדינות חמישה מיליליטר של מצע תרבית חם מראש לצלחת התרבית, ולאחר מכן דגרו במשך 24 שעות לפני ביצוע הקלטות מחוברות לתא. לאחר מקום הדגירה, הכיסוי בגודל 12 מילימטר מחליק המכיל את תאי יותרת הכליה לתמיסה החוץ-תאית. מכיוון שנעשה שימוש בכל בלוטות יותרת הכליה, השלב הבא הוא להבדיל בין תאי הכרום לתאי קליפת המוח.
בתרבית, תאי הכרומין בדרך כלל בהירים מאוד עם צבע בז' חום וצורה מעגלית כמעט מושלמת. לעומת זאת, תאי קליפת המוח קטנים ועמומים יותר מתאי ה-CHRO. לאחר משיכת פיפטות התיקון כמתואר בפרוטוקול הטקסט, טבלו את קצה הפיפטה בשעווה מומסת כדי להפחית את קיבול הזכוכית.
לאחר מכן יש ללטש את הקצה באש כדי לפוצץ את השעווה הזו מתוך קצה הפיפטה. לאחר מכן, בנה את הפיפטה עם תמיסת פיפטת התיקון כך שההתנגדות שלה תהיה כשני מגה אוהם. חבר את פיפטת התיקון למניפולטור שלה והביא אותה למרחק של כמה מיקרונים מהתא.
המשך לקדם את הפיפטה בחיפוש אחר עיוות קל בתאים. לאחר זיהוי העיוות, הפעל יניקה עדינה עד להשגת איטום ג'יגה-אום. מניב תצורה מחוברת לתא.
לאחר חשיפת חותם ג'יגה אום, בצע הקלטות מחוברות לתא באמצעות מגבר מהדק EPC שבע פלוס תיקון, ומגבר נעילה אנלוגי דו-פאזי כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הגדר את השלב של מגבר הנעילה, כך ששינויים בקיבול חולף המיוצרים על ידי יניקה עדינה. פולסים מופיעים רק בקיבול התיקון, או עקבות Im ללא הקרנה לתוך התיקון, מוליכות או שחזור תהליך התיקון משמש כגירוי מכני. מכיוון שניתן לרשום זרם פעולה בדרך כלל מרוב התאים, זהה שינויי קיבול אופייניים על ידי הצעד המסומן כלפי מטה.
השלב האחרון הוא שמירת הנתונים לניתוח עתידי. מוצגת כאן הקלטת קיבול טיפוסית המחוברת לתא עם מספר שלבים כלפי מטה. כל שלב כלפי מטה קשור לאנדוציטוזיס iCal יחיד.
לאחר השליטה, ניתן להשלים את תרבית התאים תוך שעתיים-שלוש, וניתן לבצע הקלטות תוך ארבעת הימים הבאים לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההעברה הסינפטית לחקור את מיחזור השלפוחית הסינפטית בתאי כרומין נוירואנדוקריניים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בזיהוי אקסוציטוזה ואנדוציטוזה של וסיקולות בודדות בתאי כרומפין של בלוטת התת-ריניי בעכברים. השיטה כוללת patch clamping להשגת רישומי קיבול (capacitance) של תאים מחוברים, המאפשרים תצפית על אקסוציטוזה ואנדוציטוזה של וסיקולות בודדות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- אקסוציטוזה היא תהליך של היתוך של שלפוחיות עם ממבrane הפלזמה.
- אנדוציטוזה מחזרת את הממברנה שהתמזגה ויוצרת מחדש שלפוחיות סינפטיות.
- הבנת תהליכים אלו חיונית להשגת תובנות לגבי תמסורת עצבית.
- מדידות קיבול (Capacitance recordings) מספקות שיטה לניתוח אירועים אלו ברמת השלפוחית הבודדת.
מטרת המחקר
- לגילוי וניתוח של ציטוזיס ואנדוציטוזיס של וזיקולה בודדת.
- לשיפור שיטות קיימות לחקר דינמיקה של וזיקולות.
- להעמקת ההבנה של מנגנוני העברה סינפטית.
שיטות שהשתמשו בהן
- עיכול של רקמת בלוטת על-כליה של עכבר להשגת תאים.
- דיסוציאציה והשתלה של תאי כרומפין של בלוטת על-כליה.
- זיהוי תאי כרומפין לצורך patch clamping.
- הקלטות קיבול (capacitance) בתצורת cell-attached לצפייה בדינמיקה של שלפוחיות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של אקסוציטוזה ואנדוציטוזה של וסיקולה בודדה.
- הדגמת היתרונות של רישומי קיבול (capacitance recordings) על פני שיטות מסורתיות.
- מתן תובנות לגבי המנגנונים של מיחזור וסיקולות סינפטיות.
- תרומה להבנת תהליכי שחרור מוליכים עצביים.
מסקנות
- הטכניקה מאפשרת מחקר מפורט של דינמיקת שלפוחיות.
- הממצאים משפרים את ההבנה של העברה סינפטית.
- יישומים פוטנציאליים בחקר תהליכים נוירוביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מדידות קיבול (capacitance) ברזולוציה גבוהה בשיטת cell-attached בתאי כרומפין של בלוטת האדרנל בעכברים מאפשרות כימות ישיר של אנדוציטוזה של שלפובית בודדת, תהליך קריטי במיחזור של שלפוביות סינפטיות. יכולת זו מחזקת את הפחתת הסיכונים המכניסטיים ואת הביטחון החזוי באישור מטרות בשלב מוקדם של נוירוביולוגיה. השיטה תומכת ברצף תרגומי על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על דינמיקה של שלפוביות הרלוונטית להעברה עצבית ולתפקוד נוירואנדוקריני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של מנגנוני מיחזור של ואזקולות ברמת האירוע הבודד.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות כימות של קינטיקת האנדוציטוזה בתאים נוירואנדוקריניים.
- מפחית עמימות מנגנונית במחקרי תמסורת סינפטית.
- מעלה את רמת הביטחון החזויה עבור פורטפוליוים הממוקדים בנוירוביולוגיה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מדדים אלקטרופיזיולוגיים מהימנים לפיתוח בדיקות המשך.
- מאפשר סטנדרטיזציה של זיהוי אירועי שלפוניות עבור תהליכי סריקה הניתנים לשחזור.
- מספק פלטים כמותיים המתאימים להערכת תרכובות בבדיקות תפקוד סינפטי.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה במערכות מודל נוירו-אנדוקריניות.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתואם עם מודלים הרלוונטיים למחלות עבור שחרור מוליכים עצביים ומחזור של שלפוחית.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני של מטרות סינפטיות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון בהתבסס על דינמיקה כמותית של שלפוחית.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית עבור תוכניות של תמסורת סינפטית ונוירו-אנדוקרינית.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים ועד לאישור מודלים פרה-קליניים, והיא תומכת הן בתיקוף מטרות והן בפיתוח בדיקות למחקר בתחומי התמסורת הסינפטית והנוירואנדוקרינית.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת אירועי אנדוציטוזה כדי להבהיר מסלולי מיחזור של וסיקולות ולבדוק היפותזות מכניסטיות.
- סריקה: מספק מדידות קיבוליות כמותיות וניתנות לשחזור לצורך מוכנות הבדיקה וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק קריאות ברזולוציה גבוהה להשוואת תנאים ניסויים ופרמטרים קינטיים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי הגילוי למודלים פרה-קליניים של שחרור מוליכים עצביים ותפקוד סינפטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית לשימוש חוזר עבור יוזמות מו"פ מגוונות בנוירוביולוגיה.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית אי-ודאות מכניסטית בביולוגיה סינפטית.
- ערך תפעולי: מספק מדידות אלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובעלות יכולת התרחבות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך תהליך הפיתוח (go/no-go) ויעילות הון על ידי מתן אפשרות לתיקוף יעדים איתן.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות של נוירוביולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה בשיטת patch clamp ובזיהוי תאים.
- נדרשים מגברים ייעודיים ותשתית אנליטית להקלטות קיבול (capacitance).
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להבטחת שחזוריות.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה לסוגי תאים נוירואנדוקריניים או נוירונליים שונים.
- אתגרים טכניים כוללים השגת אטמים בדרגת giga-ohm והבחנה בין תתי-סוגי תאים.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Adrenal Gland Isolation
2:52
Tissue Digestion
3:50
Cell Dissociation and Plating
5:16
Cell Identification and Gigaohm Seal Formation
6:41
Cell-attached Capacitance Recordings
7:34
Results: Cell-attached Capacitance Recording Shows Endocytosis in Chromaffin Cells
7:52
Conclusion
