בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אוכלוסיות תאים ספציפיות מהמוח הקטן המתפתח. זה מושג על ידי קצירת המוח הקטן מעכברים יילודים הנושאים חלבונים פלואורסצנטיים. השלב השני של ההליך הוא השגת קטעי רקמה חיים באמצעות ויברטו.

השלב השלישי הוא מיקרו-דיסקט של שכבת הנבט החיצונית של המוח הקטן תחת מיקרוסקופ חיתוך פלואורסצנטי. השלבים האחרונים הם לפרק את הרקמה לתרחיף תא בודד ולאסוף תאים על ידי מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שניתן לבודד אוכלוסיות תאים ספציפיות מהמוח הקטן.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון לכידת לייזר, מיקרו דיסקציה, הוא שהתאים חיים וניתנים לתרבית. לניסויים נוספים לצורך הליך זה, יש לעקר את כלי הניתוח באמצעות חיטוי. קבל טרי או מחומם מחדש ב-3% נמס נמוך מוכן לשימוש באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

להמציא את הפתרונות הנדרשים לדיסוציאציה של תאים מבוססי פפאיה. הכן מדיה תרבותית טרייה של NBB 27. לאחר מכן מסננים, מעקרים ומאחסנים בחממה.

הכן את מאגר הפקס והכן את פתקי הכיסוי של פולי דה ליצין. כיסוי חיטוי מעיל ראשון מחליק עם 100 מיקרוגרם פולי דה ליצין למיליליטר מים סטריליים. לאחר מכן דגרו את החלקות הכיסוי למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או לילה בטמפרטורת החדר.

מאוחר יותר, שטפו את פתקי הכיסוי במים מזוקקים ולאחר מכן במדיה NBB 27 לפני השימוש בפתקי הכיסוי. יבש אותם לחלוטין. זה ייקח לפחות שעה לפני שמתחילים.

הכן תחילה את אזור הדיסקציה. נגב אותו עם 70% אתנול. לאחר מכן מכסים אותו בפד סופג.

שנית, הוציאו את הכלים מתיק העיקור והניחו אותם לשימוש. שלישית, העמיסו צלחת עם DPBS סטרילי קר כקרח עם רצועת עט של 1% והניחו אותה על קרח. נתחו את מוחו של גור P 4 המבטא סמנים פלואורסצנטיים.

ואז העבירו אותו למנה המוכנה של DPBS. השתמש במלקחיים כדי להפריד בזהירות את המוח הקטן משאר המוח. המוח הקטן הזה מבטא את הסמנים math one, GFP ו-nest ב-CFP שבו ה-EGL מבטא GFP והשכבה המולקולרית חיובית ל-CFP.

לאחר מכן, מלאו תבנית הטבעה קוביות של שני סנטימטרים בתמיסת האגרו. ודא שהוא לא חם יותר מ-37 מעלות צלזיוס. הרם מוח קטן בעזרת כף מחוררת ורפד אותו יבש עם טפיחה עדינה של טישו.

לאחר מכן בעזרת מלקחיים, הכניסו אותו לתבנית. השתמש במחט כדי להכניס את המוח הקטן לכיוונים אנכיים. פעם אחת נטענים כארבעה לתבנית.

מניחים את התבנית על קרח כך שהיא תתמצק במהירות בעזרת סכין גילוח. חתוך את הבלוק כדי להפחית את זמן החיתוך. ואז הדביקו את הבלוק לצלחת מכוונת כך שהמוח הקטן יהיה אנכי.

טען את מגש המילוי עם DPBS קר כקרח עם רצועה כבושה של 1% והניח קרח מתחת למגש כך שיישאר קר. כעת חתכו את הבלוקים בעזרת ויברטור. חותכים ואוספים חלקים של 600 מיקרון.

מוציאים אותם ממגש הקרח בעזרת כף מחוררת ומעבירים אותם לכלי מלא A-D-P-B-S על קרח. תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי. בחן את הפרוסות במהירות האפשרית.

הפרד בזהירות את ה-EGL משאר החלק הקטן. השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתח בין השכבה המולקולרית החיובית של CFP לבין ה-EGL החיובי של GFP. היו שמרנים מאוד במהלך מיקרו-דיסקציה כדי למנוע זיהום מאזורים סמוכים.

העבר את רקמת ה- EGL החיובית של GFP לצלחת חדשה מלאה ב- DPBS על קרח. הימנע מהכללת רקמת שכבה מולקולרית כלשהי מכיוון שהדבר יזהם את התרבית בקינון המבטא גליה ברגמן. לאחר מכן, הסר את האגרוס המקיף את רקמת ה- EGL המבודדת.

כעת ניתן לנתק את ה-EGL באמצעות פרוטוקול מבוסס פאן עבור תרחיף תא בודד. לאחר השלמת הפעולה, השהה את התאים במאגר הפקס. המשך באיסוף תאי CFP באמצעות פקס.

מיין אותם באמצעות ציטומטר במהירות גבוהה ומסנן CFP ומשוך אותם למאגר פקס קר כקרח. יש להשיג כ-100,000 NPS לכל P ארבע מוח קטן. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים המאוגדים ב-300 Gs למשך חמש דקות.

עשה שימוש מיידי בתאים כדי לתרבית אותם לחיים. השעו אותם במדיה NBB 27 חמה מראש. לאחר מכן טען אותם על החלקות הכיסוי המצופות פולי D ליזין.

פרוסות בלה תאים הוכנו מ-P ארבע מתמטיקה, קן GFP אחד בעכברי CFP. EGL המוח הקטן הכיל בעיקר GFP המבטא GMPs וניתן היה להפריד אותו בקלות מהשכבה המולקולרית המועשרת ב-CFP המבטא גליה ניתוח עובדות הראה שיותר מ-85% מהתאים ב-EGL היו GNPs קונבנציונליים. NEPs בודדו מהחלקים העמוקים של ה-EGL על ידי מיקרו-דיסקציה, ואחריהם עובדות.

תאים אלה היוו כ-5% מהתאים ב-EGL במשך ארבעה ימי תרבית. העובדות שבודדו NPS הולידו בטא טובולין המבטא נוירונים. זה מאפיין תאי אב עצביים מוגבלים בשושלת.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות ולשמור על הרקמה על קרח ככל האפשר.