קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לקבוע את הריכוז הוויראלי באמצעות כימות של ויריונים זיהומיים על ידי ספירה של פלאקים (plaques) נפרדים בתרבית תאים. דבר זה מושג תחילה על ידי זריעת תאים ליצירת שכבה Ein-layer (מונולייר) רציפה להדבקה. השלב השני הוא ביצוע דילול סדרתי של דגימה ויראלית לא ידועה שיש לכמת. לאחר מכן, מדביקים את השכבות הרציפות באמצעות הדילול הסדרתי של המאגר הוויראלי, ולאחר מכן מיישמים שכבת כיסוי (overlay) למניעת תנועה. השלב הסופי הוא קיבוע וצביעה של הפלאקים לאחר זמן אינקובציה מתאים עבור הנגיף המדובר, וזאת כדי לספור את הפלאקים הנפרדים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בבדיקות פלאק ולהתאימן במספר דרכים שונות כדי לקבוע את הטיטר הוויראלי של דגימה ויראלית לא ידועה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כיסוי חצי-מוצק (semi-solid overlay), הוא שההחלה וההסרה פשוטות בהרבה הן ביישומים בעלי תפוקה גבוהה (high throughput) והן ביישומים מסורתיים. בנוסף, אין צורך בחימום של הריאגנטים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מחקרם של וירוסים ליטיים רבים ושונים, שכן השימוש בכיסוי נוזלי בפורמט של 96 בארות מאפשר סריקה מהירה של תרכובות טיפוליות חדשניות, מה שיכול להפחית משמעותית את שעות העבודה המרובות במעבדה לביצוע בדיקות פלאקים מסורתיות.

ביום שלפני הבדיקה, זרעו את התאים המתאימים עבור הווירוס הנדון כדי להגיע ל-90 עד 100% התלכדות (confluency) ביום ההדבקה. ניתן להכין גם את תמיסות המלאי יום לפני הבדיקה. ראשית, הכינו תמיסת קיבוע של 10% formaldehyde במים מזוקקים על ידי ערבוב של 5.56 milliliters של תמיסת מלאי 36% formaldehyde עם 14.44 milliliters של מים מזוקקים. לאחר מכן, הכינו את צבע הקריסטל ויולט (crystal violet), המורכב מ-1% crystal violet ב-20% ethanol המדולל במים מזוקקים. בשלב הבא, בעבודה בתנאים סטריליים, הכינו את מצע הפלאקים (plaque media) בריכוז 2x המתאים לסוג התאים שבשימוש. סננו את התמיסה דרך מסנן 0.2 micron אם חלק מהריאגנטים אינם סטריליים. כדי להכין שכבת כיסוי נוזלית (liquid overlay) לשימוש בבדיקת הפלאקים, הוסיפו 2.4 grams של Avicel לבקע המכיל 97.6 milliliters של מים מזוקקים בערבוב מהיר באמצעות מגנט ערבוב. ערבבו את התמיסה בטמפרטורת החדר עד שהיא תהפוך לצמיגה מדי עבור מגנט הערבוב. בנקודה זו, העבירו את הבקע למכשיר ניעור (flask shaker) וניערו אותו בעוצמה למשך 30 דקות כדי להבטיח הומוגניזציה אחידה. לבסוף, סטריליזו את התמיסה באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 degrees Celsius בלחץ של 14 PSI למשך 30 דקות.

עם סיום התוכנית, יש לאחסן את המבחנות כשהן אטומות בטמפרטורת החדר. עבור שכבת אגרוז (agarose overlay), הכין תמיסת סטוק של 0.6% agarose במים מזוקקים, ערבב באמצעות מגנט Stir bar והעבר באוטוקלאב להמסה מלאה. עבור שכבת carboxymethylcellulose, הכין תמיסה של 2% carboxymethylcellulose במים מזוקקים וערבב. לאחר מכן, בצע אוטוקלאב כפי שפורט קודם לכן.

ביום שאחרי הזריעה, השתמשו במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את רמת ההצפיפות (confluency) ואת חיוניות התאים לפני תחילת הבדיקה. ודאו כי התאים מראים מורפולוגיה תאית סטנדרטית ורמת הצפיפות היא כ-90%.

בצעו דילול סדרתי של פי עשרה לדגימות הזיהומיות במצע גידול תאי, תוך שינוי מספר הדילולים הנדרש בהתאם לטר (titer) הצפוי של הנגיף המדובר. כמו כן, הכינו דגימת ביקורת לא זיהומה כדי להבטיח באופן עצמאי את חיוניות התאים ולסייע בזיהוי הפלאקים. טפטפו באמצעות פיפט את ביקורת הלא-זיהומה ואת הדילול הסדרתי לתוך בארות הפלטה, תוך הקפדה על מניעת פגיעה בשכבה החד-תאית (monolayer).

השתמשו בנפח מספיק של אינוקולום כדי לכסות את התאים, תוך שמירה על נפח נמוך ככל האפשר כדי למקסם את המגע של הווירוס עם השכבה החד-שכבתית (monolayer). הכניסו את הצלחות לאינקובטור לתרביות רקמה והדביקו את התאים למשך 45 דקות עד שעה. בכל 20 דקות נערו בעדינות את הצלחות כדי להבטיח כיסוי אחיד ולמנוע את התייבשות השכבה התאית.

במהלך ההדבקה, הכינו את תמיסת העבודה לשכבת הכיסוי (overlay) עבור כיסויי נוזלים. ערבבו מצע פלאקים מחומם עם Stock Avicel בטמפרטורת החדר בריכוז של 1.2% עד 2.4% ביחס של אחד לאחד, כדי לקבל תמיסת עבודה של מצע כיסוי Avicel בריכוז של 0.6% עד 1.2%. עבור כיסויי אגרוז או CMC, ערבבו מצע פלאקים מחומם עם תמיסת סטוק של אגרוז 0.6% מחומם או CMC 2% ביחס של אחד לאחד. לאחר מכן, הניחו את התמיסה במקלחת במעלה של 56 °C למשך 30 דקות לצורך השוואת טמפרטורות. ודאו שהתמיסה חמימה אך לא רותחת למגע כדי למנוע מוות של תאים וירידה בתארים הוויראליים. לאחר ההדבקה, מרחו את שכבות הכיסוי על השכבות התאיות המודבקות (infected monolayers). לאחר הוספת שכבת הכיסוי, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך יומיים עד 14 ימים, בהתאם לנגיס המנותחת.

לקיבוע תאים באמצעות כיסוי נוזלי, שפכו או שאבו את כיסוי ה-Avicel, ולאחר מכן העבירו בפיפטה תמיסת formaldehyde בריכוז 10% אל הבארות וקבעו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ועד ללילה. עבור agarose או CMC, הוסיפו ישירות את תמיסת ה-formaldehyde אל הכיסוי למשך שעה אחת ועד ללילה בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, השליכו את ה-formaldehyde ולאחר מכן הסירו ידנית את פקקי ה-agarose החצי-מוצקים באמצעות השפכטל.

שטפו את לוחות התאיים של ה-Avicel במים כדי להסיר שאריות של מקבע השכבה העליונה לפני הצביעה.

לצביעה, כסו את התאים בכמות מינימלית של תמיסת קריסטל ויולה (crystal violet) למשך כ-15 דקות. נערו את הצלחות במידת הצורך כדי להבטיח כיסוי אחיד. שטפו בעדינות את צבע הקריסטל ויולה באמצעות מים. לאחר הקיבוע, הצביעה והייבוש, ניתן לאחסן את הפלאקים ללא הגבלת זמן לצורך ניתוחים עתידיים. ספרו את הפלאקים בכל באר, תוך פסילת בארות עם פחות מחמישה או יותר מ-100 פלאקים. חשבו את הממוצע עבור חזרות טכניות של אותה דילול. שימו לב לגודל הפלאקים ולמורפולוגיה שלהם. קבעו את הטר של הדגימה המקורית (viral titer) על ידי חישוב הממוצע של מספר הפלאקים עבור דילול מסוים וההופכי של מקדם הדילול הכולל.

תמונה זו מציגה השוואות של כיסויי פלאקים (plaque overlay) של נגיף חום עמק הסדקים תוך שימוש בלוחות של 12 בארות. תאי Veros נזרעו בריכוז של 2.5 × 10⁵ תאים בלוחות של 12 בארות והודבקו בנפח של 200 µL באמצעות אותה דגימת התחלה של MP 12 בדילול סדרתי. לאחר ההדבקה, הונחו כיסויים בנפח של 1.5 mL של 0.3% agarose, 0.6% Avicel או 1% CMC כדי להשוות ישירות בין הכיסויים. היסטוגרמה זו מציגה את תוצאות ספירת הפלאקים והטיטרציה עבור שלושת הכיסויים. כאן מוצגות השוואות של כיסויי פלאקים של VEEV תוך שימוש בלוחות של 12 בארות. תאי Veros נזרעו כפי שנעשה קודם לכן והודבקו בנפח של 200 µL באמצעות אותה דגימת התחלה בדילול סדרתי של זן החיסון VEEV-TC 83; לאחר ההדבקה, הונחו כיסויים בנפח של 1.5 mL של 0.3% agarose, 0.6% Avicel או 1% CMC כפי שנעשה קודם לכן.

שוב, ההיסטוגרמה מציגה את תוצאות ספירת הפלאקים והטיטרציה עבור כל שלוש שכבות הכיסוי. תמונה זו מראה דוגמה לשכבות כיסוי של פלאקים בתפוקה גבוהה. פלטת 96 בארות של תאי Veros, שסודרו בריכוז של 3×10⁴ תאים לבאר, הוחדרה ב-50 µL של אינוקולום תוך שימוש באותה דגימת מוצא של נגיף ה-Rift Valley fever MP 12 בדילולים סדרתיים, למשך שעה אחת בארבע חזרות. עבור שכבות הכיסוי, נבחנו ריכוזים סופיים של 0.6% ו-1.2% של Avicel כדי לקבוע את ההיתכנות והשחזוריות של שימוש בשכבות כיסוי נוזליות באופן של תפוקה גבוהה. היסטוגרמה זו מציגה את הטיטרים שנקבעו מכל שכבת כיסוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שכל נגיף הוא שונה, וייתכן שיהיה צורך בביצוע אופטימיזציות הכוללות שימוש בסוגי תאים שונים, זמני אינקובציה ו/או מצע גידול שונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקת פלאקים (plaque assay) בסיסית תוך שימוש בשכבות כיסוי נוזליות וחצי-מוצקות.