שימוש בelectroretinogram כדי להעריך את התפקוד ברשתית מכרסמים וההשפעות המגנות של האיבר המרוחק איסכמי אכשור קד
9 ביוני 2015
האלקטרורטינוגרמה (ERG) היא פוטנציאל חשמלי שנוצר על ידי הרשתית בתגובה לאור. מאמר זה מתאר כיצד להשתמש ב-ERG כדי להעריך את תפקוד הרשתית, בחולדות מותאמות לחושך, וכיצד ניתן להשתמש בו כדי להעריך התערבות נוירו-פרוטקטיבית, במקרה הנוכחי התניה איסכמית מרחוק.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את תפקוד הראייה בחולדות רגילות, פגועות אור ומרוחקות, איסכמיות מותנות מראש ופצועות קלות באמצעות ה-ERG ובכך להדגים את ההשפעות המגנות של איסכמיה מרוחקת על הרשתית. זה מושג על ידי החשיכה הראשונה, התאמת החולדות למשך 12 שעות. השלב השני הוא להקליט את ה-ERG המותאם לחושך הבסיסי באמצעות גירוי אור LED ומגבר דיגיטלי.
לאחר מכן, חשפו את החולדות ללחץ ברשתית על ידי חשיפתה לאור רציף בהיר. השלב האחרון הוא להשוות את רישומי ה-ERG של חולדות עם נזקי אור ואלה המותנים מראש באיסכמיה של גפיים מרוחקות, ולמדוד את תגובות קולטני האור כפי שנראות בגל A ואת תגובות הרשתית הפנימיות כפי שנראות בגל B. בסופו של דבר, ה-ERG המותאם לחושך משמש להערכת תפקוד הראייה הסקוטופית.
כך ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הגנה עצבית מבוססת איסכמית מרחוק. ניתן ליישם אותו גם על צורות אחרות של פגיעה ברשתית ובדיקות תרופתיות למחלות, ולהקרנה של בעלי חיים עם ליקויי ראייה. כדי להתחיל בהליך זה, התאם את החולדה בחושך למשך 12 שעות, ואז הרדים אותה בהזרקת קוקטייל קטמין קסילזין.
ברגע שהחיה מחוסרת הכרה, בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטה קלה של כף הרגל כדי לוודא שתגובת הרפלקס נעדרת. לאחר מכן, מרחו טיפת אטרופין וטיפה של פרוקס מתאן על הקרנית שלו. חותכים לחוט שחור באורך 10 סנטימטרים.
לאחר מכן צרו לולאה עם החוט והחליקו את הלולאה מעל קו המשווה של העין, סרוגה מעט הדוקה על מנת למשוך את גלגל העין מעט קדימה ולשמור על הקרנית נקייה מהעפעף. לאחר מכן, מרחו טיפות עיניים של קרמר על הקרניות. מקם את החולדה על המצע הסופג על גבי הפלטפורמה המחוממת כשראשה מונח בפתח הגנצפלד.
לאחר מכן הכנס את בדיקת הטמפרטורה הפנימית לתוך פי הטבעת כדי להבטיח שטמפרטורת הגוף נשמרת על 37 מעלות צלזיוס, ואבטח את בדיקת הטמפרטורה במקומה על ידי הדבקת החוט שלה לזנב החולדה. לאחר מכן, הכנס את אלקטרודת הייחוס תת עורית לגפה האחורית. הנח את האלקטרודה השלילית היטב בפה כדי למנוע מהאלקטרודה להחליק מהפה.
הצמד את כבל החיבור למשטח יציב. לאחר מכן מקם את האלקטרודה החיובית מעל מרכז הקרנית וודא שהאלקטרודה נוגעת בקרנית בעדינות באמצעות מניפולטור מיקרום. לאחר שהאלקטרודות נמצאות במקומן, עטפו את החור שהוקם, כולל הגנצפלד והחיה בחומר אטום כדי לשמר את ההסתגלות לחושך.
בתוכנת הרכישה. הגדר שני קילו-הרץ כקצב דגימה עם חמש אלפיות השנייה לדגימה לפני האיסוף וזמן איסוף של 100 עד 1000 אלפיות השנייה. לאחר מכן הגדר את מסנני מעבר הפס לאחד עד 1000 הרץ וודא שהדגימה מופעלת לתקופה של 100 אלפיות השנייה לאחר הבזק.
כעת, בדוק את קו הבסיס של ההקלטה. זה צריך להיות נקי מרעשים זרים, אך להראות את רעש המגבר ותנודות הנשימה. לאחר מכן הפעל פלאש בדיקה.
זוהי צורת גל טיפוסית של ERG בתגובה להבזק הבדיקה. בסיום, אפשר לבעל החיים להסתגל מחדש לחושך למשך 10 דקות. לאחר מכן בדוק שוב את קו הבסיס לאיתור אות יציב.
לאחר מכן, התחל את ההקלטה בתום סשן ההקלטה, בדוק את יציבות טמפרטורת הגוף של החיה. הסר את האלקטרודות ולאחר מכן החל מחדש את פולימר הקרמר על הקרניות. לאחר מכן, אפשרו לבעל החיים להתאושש על כרית חום עד שהוא נייד ופעיל לחלוטין לפני החזרה לבית החיה.
איור זה מציג את המדידה של גל וגל B מ-ERG מותאם כהה. העקבות המוצגים כאן מתועדים מהקרנית של עין מותאמת כהה להבזק אור בהיר שניתן בזמן המוצג כ-T אפס. משרעת הגל נמדדת מקו הבסיס לשוקת הראשונה.
המשרעת של גל B נמדדת משוקת גל A לשיא החיובי הבא. ההשהיה נמדדת מחפץ הגירוי לנקודת העניין על המעקב, כגון שוקת גל A. אות ה-ERG הגולמי הנשלט גדל עם גירוי האור הגובר.
גל מתגלה בערך ב-0.4 לוג קנדלה סקוטופית שניות למטר בריבוע, ופרדיגמת ההבזק התאום שימשה להפרדת אות ה-ERG המעורב לתגובות חרוט ומוט. ברגע ששולטים. ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עושה שימוש באלקטרו-רטינוגרמה (ERG) כדי להעריך את תפקודי הרשתית בחולדות שהותאמו לחושך. הוא בוחן באופן ספציפי את ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות של התניה מוקדמת לאיסכמיה מרוחקת (remote ischemic preconditioning) על תגובות הרשתית בעקבות דחק המושרה על ידי אור.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- הערכת תפקוד הרשתית
רקע
- האלקטרו-רטינוגרם (ERG) מודד תגובות חשמליות של הרשתית לאור.
- הסתגלות לחושך היא קריטית להערכה מדויקת של ERG.
- ה conditioning איסכמי מרוחק עשוי להעניק הגנה עצבית לתאי הרשתית.
- חשיפה לאור עלולה לגרום למעקה של הרשתית, ובכך להשפיע על התפקוד החזותי.
מטרת המחקר
- להערכת התפקוד הראייתי בחולדות רגילות ובחולדות שעברו התנייה מוקדמת באמצעות ERG.
- להדגמת ההשפעות המגינות של איסכמיה של גפה מרוחקת על בריאות הרשתית.
- להשוואת תגובות ERG בין חולדות עם פגיעת אור לחולדות שעברו התנייה מוקדמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הסתגות של חולדות לחושך למשך 12 שעות לפני הבדיקה.
- הקלטת ERG בסיסית במצב הסתגות לחושך באמצעות גירויי אור LED.
- השראת עקה רשתית באמצעות חשיפה לאור רציף חזק.
- השוואת הקלטות ERG למדידת תגובות הפוטורצפטורים והשכבות הפנימיות של הרשתית.
תוצאות עיקריות
- הקלטות ERG בסיסיות נקבעו עבור חולדות שהותאמו לחושך.
- חשיפה לאור הובילה לשינויים מדידים בתגובות ה-ERG.
- חולדות שעברו התניה מוקדמת הראו שיפור בתגובות הרשתית בהשוואה לחולדות שלא עברו התניה מוקדמת.
- הממצאים תומכים בהשערה של נוירופרוטקציה באמצעות התניה איסכמית מרוחקת.
מסקנות
- ה-ERG הוא כלי יעיל להערכת תפקוד הרשתית תחת עקה.
- ה conditioning איסכמי מרוחק עשוי למתן נזק לרשתית המושרה על ידי אור.
- מחקרים עתידיים יוכלו לבחון יישומים טיפוליים של התערבות זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכת אלקטרו-רטינוגרמה (ERG) במודלים של מכרסמים מאפשרת הערכה כמותית של תפקוד הרשתית והתערבויות נוירו-פרוטקטיביות, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות Oftalmic. היכולת של הפרוטוקול להבחין בין תגובות של תאי קולחים (rods) ותאי קונוסים (cones) ולמדוד תוצאים תפקודיים לאחר התניה מוקדמת של איסכמיה בגפה מרוחקת, מספקת ביטחון ניבוי להפחתת סיכונים מכניסטיים ולהמשכיות תרגומית. גישה זו רלוונטית ישירות למיון פורטפוליו ותיעדוף של אסטרטגיות נוירו-פרוטקטיביות במסלולי פיתוח פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות נוירו-פרוטקטיביות במודלים של פגיעה ברשתית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות תגובות של פוטורצפטורים ושל הרשתית הפנימית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד תרומותיהם של מסלולי הפוטורצפטורים מסוג rod ו-cone.
- מספק ביטחון חיזוי להקדמת מועמדים לנוירו-פרוטקציה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מגדיר פרוטוקולי ERG מתוּקפים וניתנים לשחזור לצורך סריקה תפקודית של התערבויות.
- מספק תוצאות כמותיות וסטנדרטיות (אמפליטודות של גל A וגל B) לצורך הערכת תרכובות.
- מאפשר סקליביליות ושימוש חוזר בפלטפורמה במודלים פרמקולוגיים וגנטיים של פגיעה ברשתית.
- תומך בסריקת בעלי חיים עם פגמים חזותיים לצורך בחירת מועמדים פרה-קליניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים נקודות קצה פונקציונליות של ERG למודלים של פגיעה רשתית הרלוונטיים למחלה.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות לנוירופרוטקציה.
- תומך בקבלת החלטות על קידום מבוסס התאמת סיכונים, בהתבסס על תוצאות פונקציונליות כמותיות.
- מקל על פיתוח ביומרקרים תרגומיים לנוירופרוטקציה של הרשתית.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד
פרוטוקול ה-ERG משלב שלבים החל מגילוי מוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, ותומך בבדיקת השערות, בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובהערכה כמותית של התערבויות נוירופרוטקטיביות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת מדדים תפקודיים להערכה מונחית-היפותזה של מנגנוני הגנה על הרשתית.
- סריקה (Screening): מספקת פלטי ERG כמותיים וניתנים לשחזור לסריקת תרכובות והתערבויות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של אמפליטודות וזמני השהייה (latencies) של גל A וגל B לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים באמצעות נקודות סיום תפקודיות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית ובעלת פולשנות מינימלית, הניתנת להתאמה למגוון מחקרים של פגיעות רשתית והגנה עצבית (neuroprotection).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי נוירופרוטקציה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכה פונקציונלית, המבטיחה שחזוריות ויכולת הרחבה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי אספקת נקודות קצה פונקציונליות חסונות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מועמדים לנוירופרוטקציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה ובטיפול במכרסמים להשגת תוצאות ERG אמינות.
- דורש אספקת גירוי אור קלוב (calibrated) ומיקום מדויק של האלקטרודות לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ההרדמה, ההסתגלות ופרמטרי ההקלטה.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של פגיעות ברשתית ולמחקרים של התערבות נוירופרוטקטיבית.
- רגישות מוגבלת לזיהוי נזקים מקומיים ברשתית; מתאים ביותר להערכה תפקודית של כל הרשתית (pan-retinal).
