אופטימיזציה של ההגדרה והתנאים עבור אלקטרורטינוגרמה של Ex Vivo כדי לחקור את תפקוד הרשתית בעיניים קטנות וגדולות

פרוטוקול זה מדגים את התנאים הדרושים לשמירה על תפקוד הרשתית ב- ex vivo ERG, במיוחד גל B הרגיש ביותר המיוצר על ידי תאי ON-bipolar. עם ex vivo ERG, אנו יכולים למדוד את התפקוד של סוגים שונים של נוירונים ברשתית עם יחס אות לרעש גבוה תוך מתן אפשרות להכנסה קלה של סוכנים פרמקולוגיים. שיטה זו מקובלת במיוחד לכימות היעילות של חומרים פרמקולוגיים על תפקוד הרשתית ומחלות.

כדי להתחיל, המירו מערך רב-אלקטרודות על ידי חיבור מחזיק הדגימה ex vivo ERG למגבר דיפרנציאלי באמצעות במת ראש. יש לחבר את המגבר לכניסה האנלוגית של לוח הממשק של מערכת המערך מרובת האלקטרודות. השתמש בתוכנת ההקלטה עבור מערך האלקטרודות המרובות כדי להקליט ולאחסן את נתוני הקלט מ- ex vivo ERG.

הגדר את הרווח של מגבר הדיפרנציאל ל-100 והוסף הגברה נוספת של מתח פי 10, בהתאם למפרט הדיגיטייזר. הגדר את מסנן המעבר הנמוך ל- 100 הרץ. לחלופין, כדי להמיר מערך מהדק טלאי, חבר את מחזיק הדגימה ex vivo ERG באמצעות במת ראש למגבר דיפרנציאלי, אשר חייב להיות מחובר לבמת הראש של מגבר מהדק התיקון.

השתמש בתוכנת מערכת מהדק התיקון ובדיגיטציה כדי להקליט ולאחסן את נתוני הקלט מ- ex vivo ERG. הגדר את הפרמטרים כפי שהוצג קודם לכן. חבר נורות LED עם אורכי הגל המתאימים למיקרוסקופ.

כדי לשלוט בגירויים של אור, השתמש בדרייבר LED הנשלט על-ידי יציאות אנלוגיות מדיגיטייזר. שלוט בנורות ה- LED באמצעות תוכנת הקלטה שתאפשר הפעלה של גירויים קלים. לאחר מכן, כייל את תפוקת האור של נוריות ה-LED במיקום הרשתית במחזיק הדגימה באמצעות פוטודיודה.

במידת הצורך, הכנס מסנני צפיפות ניטרליים כדי לעמעם את עוצמת האור בנתיב האור. כדי להכין את האלקטרודה, הכנס אלקטרודת גלולת כסף כסופה כלוריד למחבר פיתיון מושחל. מלא את החלק הפנימי של מחבר הפיתיון בדבק חם, והכנס שקע של שני מילימטרים לתוך הדבק החם מהצד שאינו מושחל.

הלחמה חוט כסף של אלקטרודת EP-1 לשקע שני המילימטרים. הברג את האלקטרודה המוגמרת עם טבעת O על החוט ליציאות האלקטרודה של מחזיק הדגימה ex vivo ERG. עבור עיניים גדולות, כולל עיניים תורמות אנושיות, נקה את הגלובוס של רקמת החיבור הנותרת והסר את החלק הקדמי ואת העדשה.

השתמש באזמל כדי לבצע חתך כשלושה מילימטרים מהלימבוס. הכנס מספריים דיסקציה מעוקלים לתוך החתך לחתוך לאורך הלימבוס כדי להסיר את החלק הקדמי של העין עם העדשה. השג דגימות רשתית עבור אלקטרורטינוגרפיה ex vivo עם אגרוף ביופסיה חד פעמית של שלושה עד שישה מילימטרים.

כדי להרכיב את הרקמה על מחזיק הדגימה, הניחו את החצי התחתון של מחזיק הדגימה לתוך צלחת פטרי גדולה, ומלאו אותה במדיום איימס מחומצן כך שהכיפה של מחזיק הדגימה פשוט שקועה. תופסים בזהירות את קצה הרשתית עם מלקחיים עדינים ומעבירים את הרשתית על הכיפה של מחזיק הדגימה ex vivo, צד הפוטורצפטור פונה כלפי מעלה. הרם את מחזיק הדגימה מהפתרון של איימס, ודאג שהרשתית תישאר במקומה.

ייבש לחלוטין את הצלחת של מחזיק הדגימה כדי למזער רעשים, crosstalk חשמלי, ו shunting אותות. לאחר מכן הרכיבו את שני חצאי מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים וחברו את קו הזליפה. להניע את האלקטרודה בחצי התחתון של מחזיק הדגימה ולחבר את כבל האנודה לצד הרשתית הפנימית ואת כבל הקתודה לצד הפוטורצפטור.

השתמשו במחזיק הדגימה עם לפחות מיליליטר אחד לדקה של איימס מחומצן למשך 10 עד 20 דקות כדי לאפשר לתגובות האור להתייצב. Ex vivo ERG אפשר הקלטה של תגובות אור פוטורצפטור ותאי ON-דו-קוטביות מרשתית העכבר. הקלטה של תגובות פוטורצפטורים מרשתיות של תורמים אנושיים הייתה אפשרית עם עיכוב של עד חמש שעות לאחר המוות של enucleation ועיכוב של פחות מ-20 דקות עבור תגובות תאים ON-bipolar.

בתנאים אידיאליים, אמפליטודות התגובה והקינטיקה בשני סוגי התאים היו יציבות יחסית לאורך זמן, אך הראו ירידה איטית 40 עד 45 דקות לאחר שהרשתיות הורכבו על מחזיק הדגימה. טמפרטורה מופחתת במחזיק הדגימה האטה מאוד את הקינטיקה של קולטני פוטו ותאי ON-bipolar. עם זאת, הוא הפחית את המשרעת של גל B אך לא את גל A.

לעומת זאת, האטת קצב הזליפה הפחיתה את המשרעת של תגובות קולטני הצילום ותאי ON-bipolar, אך לא השפיעה על הזמן המרומז של גל A או B. הפסקת הזליפה למשך 10 דקות ולאחריה רפרפוזיה הביאה לאובדן מוחלט של תפקוד התאים הדו-קוטביים עם תגובות פוטורצפטור משומרות. מהירות זלוף מספקת וטמפרטורה פיזיולוגית הן קריטיות לקבלת תגובות יציבות, בפרט, מתאים ON-bipolar ב- ex vivo ERG.

פרוטוקול זה מאפשר לחקור לעומק את ההבדלים בתפקוד הפוטורצפטור במקולרי ובפריפריה האנושית, תוך מענה על שאלות שבעבר יכלו להתבצע רק בפרימטים שאינם אנושיים.