חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק חלקיקי נגיף זיהומיים המיוצרים כולית מ-cDNA משובב של נגיפי RNA בעלי גדיל חיובי, שהגנומים שלהם הם באותה קוטביות של mRNA תאי, כגון נגיף דלקת המוח היפנית. גנטיקה הפוכה מבוססת cDNA זו היא שיטה מכוננת המאפשרת מניפולציה ישירה של ה-RNA הגנומי הנגיפי, ובכך לייצר נגיפים רקומביננטיים למחקר מולקולרי וגנטי של רפליקציית נגיפים ופתוגנזה. טכניקה זו מספקת גם פלטפורמה בעלת ערך המאפשרת פיתוח של וקטורים נגיפיים של vaccinia המוגדרים גנטית לצורך העברה של גנים זרים.

שיטות אלו ישימות לשיבוט cDNA באורך מלא עבור זנים שליליים או חיוביים, ונגיפי RNA, ובמיוחד כאלה עם גנומים הגדולים מ-10 kb. את הפרוצדורה ידגימו מספר חברים במעבדתי: עוזר המחקר Sang-Im Yun, הפוסט-דוקטורנטים Byung-Hak Song ו-Jin-Kyoung Kim, והסטודנט לתואר ראשון Jordan Frank.

חלק הווידאו של פרסום זה מכסה את הכנת הכרומוזום מלאכותי בקטריאלי (BAC) המכיל את הרצפים הרלוונטיים, סינתזה של RNA המתוחבר מהפלסמיד האחורי, וכיצד למדוד את יכולת ההדבקה של ה-RNAs ואת תנובת הנגיפים. כל ההליכים שבוצעו לפני יצירת פלסמיד ה-BAC מפורטים בטקסט הפרוטוקול באופן מעמיק. לצורך הליך זה, ראשית גדלו מושבה בודדת של E. coli DH10B, הנושאת את פלסמיד ה-BAC, בשלושה מיליליטר של מצע 2X YT עם כלורמפניקול. דגרו את התרבית למשך 10 שעות ב-35 °C עם ניעור במהירות של 225 עד 250 RPM.

לאחר 10 שעות, הגדילו את נפח התרבית. לאחר מכן, הקרינו 500 µL מהתרבית לתוך 500 milliliters של מצע גידול וגדלו את התרבית במשך שש שעות עם ניעור חזק. לאחר שש שעות, סבבו את התרבית הבקטריאלית ב-2 בקבוקים של 250 milliliter במהירות של 3,100 g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, השעיו כל משקע ב-30 milliliters של תמיסת GTE.

הוסיפו 500 µL של ליזוזים והדגירו את התרחיפים על קרח למשך 10 דקות. בינתיים, הכינו תמיסת ליזיס טרייה לשלב הבא. לאחר 10 דקות, הוסיפו 60 mL של תמיסת הליזיס וערבבו בסיבוב עד שהתמיסה תיראה צלולה.

השאירו את התגובות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 45 milliliters של תמיסת נטרול לכל בקבוק והפכו את הבקבוקים עד לערבוב מלא. לאחר מכן, הניחו אותם על קרח למשך 10 דקות.

אספו את הליזאטים המנוטרלים באמצעות סרטיפוגציה בקירור ב-g גבוה. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנטים לשני בקבוקים חדשים של 250 milliliter. הוסיפו לכל אחד מהם 0.6 נפחים של isopropanol 100% והניחו אותם על קרח למשך 20 דקות.

בשלב הבא, סובבו את המשקעים למטה, לאחר מכן השליכו את הנוזלים העליונים והמיסו את המשקעים בחמישה מיליליטר של TE buffer. שלבו את שני הנפחים במבחנה אחת של 50 מיליליטר והשקיפו את ה-RNA על ידי הוספת נפח שווה של lithium chloride בריכוז five molar והדגרת התערובת על קרח למשך 10 דקות. השתמשו בסבב צנטריפוגה קר למשך 20 דקות כדי לאסוף את משקע ה-RNA.

לאחר מכן, העבירו את supernatant לשפופרת חדשה של 250 milliliter, הוסיפו שני נפחים של 100%isopropanol והניחו את השפופרת על קרח כדי שיווצר משקע של DNA. לאחר 20 דקות, סבבו את המשקע במערבל צנטריפוגי (spin down), שאבו את ה-supernatant, השעיו מחדש את כדור ה-DNA ב-9.5 milliliters של TE buffer והעבירו את תמיסת ה-DNA לשפופרת של 50 milliliter.

המשך את ההכנה על ידי הקמת מדרג של cesium chloride עם ethidium bromide. העבר את התערובת לשפופרת polypropylene ניתנת לאטימה באמצעות מזרק עם מחט gauge 18 ואטום את השפופרת. סובב את השפופרת האטומה למשך הלילה באולטרה-צנטריפוגה כדי ליצור מדרג של cesium chloride.

ביום למחרת, אספו פס DNA של פלסמיד BAC מתוך מדרג הצסיום כלוריד. השתמשו במחט בכיול 18 gauge כדי ליצור פתח לאוויר בחלקו העליון של המדרג, ובמחט בכיול 20 gauge עם מזרק כדי לאסוף את ה-BAC DNA מצד המדרג, ולאחר מכן העבירו את הדגימה לאنبוב מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 milliliter. בצעו שטיפה: הוסיפו 2.5 נפחים של butanol רווי במים וערבבו באמצעות vortexing רגיל.

לאחר מכן, סבב את התערובת בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר והעבר את הפאזה המימית התחתונה למבחנה חדשה של microfuge בנפח 1.7 milliliter. חזור על שטיפה זו סך הכל שש פעמים כדי להסיר את כל ה-ethidium bromide. כעת השקע את ה-BAC DNA. הוסף למבחנה נפח של 1/10 sodium acetate בריכוז three molar ונפח של 2.5 של 100% ethanol. דגור את התערובת על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, סבב את המשקע בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ושטוף את כדור ה-DNA באמצעות one milliliter של 70% ethanol. חזור על הסבב ואסוף שוב את הכדור. לבסוף, ייבש את ה-DNA המשוקע באוויר למשך 10 דקות והמס אותו ב-200 microliters של TE buffer.

התחל בעיכור רחב היקף של פלסמיד ה-BAC באמצעות אנזים ההגבלה Xba-one בנפח כולל של 100 microliters. בצע את העיכור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 12 עד 15 שעות. לאחר מכן, דגור את תערובת העיכור עם 25 units נוספות של mung-bean nuclease בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך שעתיים.

לאחר הדגירה, השלם את הנפח ל-300 µL באמצעות מים מזוקקים. כעת בצע מיצוי פנול על ידי הוספת נפח שווה של פנול-כלורופורם, איזואמיל אלכוהול לדגימה המדוללת, ערבוב חזק במכשיר וורטקס למשך דקה, סבוב (centrifuge) של המבחנה והעברה של הפאזה המימית העליונה למבחנה חדשה.

לאחר מכן, חזור על תהליך המיצוי עם כלורופורם. בשלב הבא, השג את ה-BAC DNA הלינארי באמצעות שיקוע אתנול. אסוף את משקע ה-DNA באמצעות סנטריפוגציה, השלך את הנוזל העליון ושטוף את המשקע ב-1 milliliter של 70% ethanol. חזור על שלב הסנטריפוגציה וייבש את המשקע באוויר. לאחר 10 דקות של ייבוש, המס את משקע ה-DNA ב-30 microliters של מים מזוקקים. לאחר מכן, בחן 1 microliter של ה-BAC שהושג על ג'ל agarose בריכוז 0.8%.

בשלב הבא, הכינו תגובת שעתוק runoff בנפח של 25 µL של ה-BAC DNA הליניארי, כולל tritiated-UTP לצורך כימות ה-RNA. בצעו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה. לאחר מכן, בחנו 1 או 2 µL מתגובת שעתוק ה-runoff על ג'ל אגרוז בריכוז של 0.6%.

התחל עם תאי BHK-21 שגודלו במשך 24 שעות בצלחות של 150 מילימטר, שבהן נזרעו 3 מיליון תאים לצלחת. שטוף את השכבה החד-תאית של התאים עם תמיסה A קרה ולאחר מכן נתק אותם באמצעות טריפסינזציה. אסוף את התאים על ידי סבוב במצנטריפוגה ב-270 g למשך שתי דקות.

לאחר מכן, השביו את התאים ב-50 milliliters של תמיסה A קרה וסבבו אותם שוב בצנטריפוגה. חזרו על שטיפה זו שלוש פעמים. לאחר השטיפה האחרונה, השביו את התאים בריכוז של 20 מיליון תאים למיליליטר בתמיסה A. לאחר מכן, ערבבו אליקוט של 400 microliter מתלי התאים עם שני מיקרוגרם של RNA סינתטי בקוובט של שני מילימטרים.

בצעו אלקטרופורציה לתערובת ללא דיחוי תחת תנאים אופטימליים והניחו לתאים לנוח במשך 10 דקות. לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנת מיקרוצנטריפוגה המכילה 600 µL של מצע גידול מלא. כעת, הכינו דילול סדרתי של פי 10 לתאים שעברו אלקטרופורציה בנפחים של 1 mL. זרעו מנות של 100 µL מכל דילול על שכבות מונואלייר של תאי BHK21 נורמליים. לאחר ארבע עד שש שעות של אינקובציה, כסו את התאים בשכבת 0.5% agarose ב-MEM בתוספת FBS וגודלו אותם במשך ארבעה ימים נוספים.

תאי BHK21 עברו אלקטרופורציה דמה (mock electroporation) או אלקטרופורציה של תמלילי RNA שהופקו משני שיבוטים (clones) עצמאיים של ה-JEV-BAC באורכו המלא. ארבעה ימים לאחר מכן, התאים נצבעו ב-crystal violet כדי להדגים את ה-RNA הזיהומי בתאים. באמצעות צביעה זו, נמדד הכמות של המוקדים הזיהומיים. לאחר מכן, נבחן ביטוי חלבון ויראלי בתאים שעברו אלקטרופורציה של RNA כ-20 שעות לאחר הטרנספקציה, תוך שימוש ב-anti-NS-one rabbit anti-serum ובנוגדן משני המצומד ל-Cy3C הנראה בצבע אדום. הגרעינים נצבעו בצביעת נגד ב-DAPI הנראה בצבע כחול. מאוחר יותר, ב-22 ו-40 שעות לאחר הטרנספקציה, נבחנה הצטברותם של ויריונים זיהומיים בתשלומי התרבית (supernatants) של תאים שעברו אלקטרופורציה של RNA באמצעות plaque assays.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק נגיף זיהומי באופן מלא מ-cDNA משובב של זן חיובי, RNA, כגון נגיף דלקת המוח היפנית. זכרו כי עבודה עם נגיף דלקת המוח היפנית ועם פתוגנים אנושיים אחרים עלולה להיות מסוכנת ביותר. הדרכה מתאימה לבטיחות ביולוגית הכרחית לפני ביצוע הליך זה.