הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס
26 בינואר 2019
כפול גדילי RNA שהופק במהלך שכפול וירוס רנ א ניתן לזהות על ידי קולטנים זיהוי תבנית כדי ליצור תגובה חיסונית מולדת. וירוסים RNA שלילי-סנס, האינטראקציה בין dsRNA ברמה נמוכה PRRs עדיין לא ברור. פיתחנו שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית להמחיש arenavirus dsRNA ו- PRR בתאים בודדים.
מסורתי כפול גדיל RNA זיהוי הראיה בדרך כלל אינו רגיש מספיק כדי לזהות RNA כפול גדיל נוצר זיהום וירוס RNA במובן שלילי. לכן האינטראקציה בין RNA כפול תקוע קולטני זיהוי דפוס המארח נשאר חמקמק במידה רבה עבור וירוסים אלה. באמצעות פרוטוקול זה אנו מסוגלים לדמיין ולאפיין את האינטראקציה בין חלבון גרעיני ויראלי, RNA כפול גדיל ולארח PRRs ברמה של תא יחיד עבור וירוס RNA תחושה שלילית. זוהי תכשיר מולטיפלקס המאפשר הכתמות בו זמנית של רנ"א דו-תקע ושני מטרות חלבון ויראליות או מארחות בתאים בודדים. שלא כמו בדיקת RNA-FISH טכניקה זו היא עצמאית רצף RNA ובדרך כלל תואם עם זיהוי נוגדנים של מטרות חלבון. התחל 24 שעות לפני ההדבקה על ידי זריעת 200, 000 תאי אפיתל ריאות אנושיים A549 על גבי כיסוי זכוכית מצופה פולי-D-לי לסין בצלחות 12 בארות והגידול שלהם ב 37
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הזיהוי של RNA דו-גדילי (dsRNA) המיוצר במהלך שכפול של נגיפי RNA על ידי קולטני זיהוי תבניות (PRRs) כדי להשרות תגובה חיסונית מולדת. המיקוד הוא בנגיפי RNA בעלי פולריות שלילית (negative-sense), שבהם האינטראקציה בין רמות נמוכות של dsRNA לבין PRRs אינה מובנת היטב. פותחה שיטת מיקרוסקופיה קונפוקלית להדמיה של dsRNA של נגיפי ארנאווירוס (arenavirus) ושל PRRs בתאים בודדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- וירולוגיה
רקע
- RNA דו-גדילי הוא תוצר לוואי של שכפול נגיפי RNA.
- קולטני זיהוי תבניות ממלאים תפקיד מכריע בתגובת החיסון המולדת.
- האינטראקציה בין dsRNA לבין PRRs בנגיפי RNA בעלי קוטביות שלילית אינה מובנת דיו.
- הדמיה של dsRNA ו-PRRs יכולה לשפר את ההבנה של חמיקת מערכת החיסון הנגיפית.
מטרת המחקר
- להבאת ביאור של האינטראקציה בין dsRNA ל-PRRs בנגיפי RNA בעלי פולריות שלילית.
- לפתח שיטה להדמיית אינטראקציות אלו בתאים בודדים.
- לתרום להבנת התגובה החיסונית המולדת לנגיפי RNA.
שיטות שהשתמשו בהן
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לוויזואליזציה של dsRNA ו-PRRs.
- בדיקות תאיות להערכת התגובה החיסונית.
- ניתוח רמות ה-dsRNA במהלך השכפול הוויראלי.
- מחקרים השוואתיים עם וירוסי RNA שונים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של dsRNA של נגיפי הארנאווירוס ושל PRRs בתאים בודדים.
- זיהוי אינטראקציות ספציפיות בין dsRNA לבין PRRs.
- תובנות לגבי מנגנוני התגובה החיסונית המופעלים על ידי dsRNA.
- הבהרת תפקידו של dsRNA בפתוגנזה נגיפית.
מסקנות
- שיטת המיקרוסקופיה הקונפוקלית שפותחה יעילה לחקר האינטראקציות בין dsRNA לבין PRR.
- הבנת אינטראקציות אלו עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד נגיפי RNA.
- מחקר זה תורם לתחום הרחב של האימונולוגיה של נגיפים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
ויזואליזציה של RNA דו-גדילי (dsRNA) בריכוז נמוך בזמן זיהום של נגיפי RNA בעל רצף שלילי מביאה מענה לפער קריטי בהבנת ההפעלה של מערכת החיסון המולדת וההתחמקות החיסונית של נגיפים. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות אנטי-ויראליות, על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על קישור של קולטני זיהוי תבניות (PRR) למתווכים שחזוריים של הנגיף. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בבחירת מטרות בשלבים מוקדמים עבור נגיפי arenavirus ופתוגנים דומים, ובכך מסייעת בתיעדוף תיקי פיתוח בתוכניות למחקר פתוגנים ברמות בידוד גבוהות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של אינטראקציות בין dsRNA ל-PRR ברזולוציה של תא בודד במודלים של נגיפים פתוגניים.
- ערך תפעולי: מספק שיטת זיהוי רגישה, שאינה תלויה ברצף, התואמת לצביעה מרובית (multiplexed) של חלבונים לצורך הבהרת מסלולים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים של מטרות PRR על ידי אישור קישור הליגנד בהקשרי זיהום רלוונטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת קריאות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית של קולוקליזציה (colocalization) בין dsRNA ל-PRR לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- רלוונטיות לסריקה: מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור סריקת תרכובות בהמשך, על ידי קביעת מדדי בסיס של הפעלה חיסונית.
- תועלת הפלטפורמה: תואמת לזיהוי מבוסס נוגדנים, מה שמאפשר שימוש חוזר עבור מטרות ויראליות וחלבונים של המארח בתהליכי דימות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תצפיות של תגליות לוולידציה פרה-קלינית על ידי מיפוי התפלגות ה-dsRNA וגיוס PRR במערכות הרלוונטיות למחלה.
- תובנה מכניסטית: מבהירה את הדינמיקה המרחבית והזמנית של סיגנלנגינג חיסוני מולד, ובכך מספקת מידע לבחירת ביומרקרים עבור מודולציה של מסלולים.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר קבלת החלטות של go/no-go מבוססות נתונים, על סמך אישור ויזואלי של מעורבות המטרה במודלים בעלי פתוגניות גבוהה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזה של מטרה, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני, ובמיוחד עבור תרופות אנטי-ויראליות אימונו-מודולטוריות המכוונות למסלולי PRR.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מנגנוני אגוניסט/אנטגוניסט של PRR על ידי ויזואליזציה של dsRNA כליגנד האנדוגני בתאים נגועים.
- סריקה: מספק פלטי דימות כמותיים וניתנים לשחזור המאפשרים השוואה של השפעות תרכובים על אינטראקציות בין dsRNA ל-PRR.
- אנליטיקה: מספק קריאות פלואורסצנציה מרובות-ערוצים (dsRNA, חלבון ויראלי, PRR) לצורך ניתוח בעל תוכן גבוה של מצבי הפעלה חיסוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תצפיות in vitro להמשכיות פרה-קלינית על ידי אישור הפעלת PRR במודלים של אפיתל ריאה ראשוני או כזה המופק מתאי גזע.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמת דימות סטנדרטית השמימה לווירוסים מרובים של RNA עם חוט שלילי ולמטרות מאכסן מעבר לארנא-וירוסים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באינטראקציות בין PRR לליגנדים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסקילביליות של הבדיקה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של מיקרוסקופיה קונפוקלית וזיהוי רגיש של dsRNA.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת ראיות חזותיות ישירות למודולציה של המסלול, ובכך מפחית נשירה בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים אימונו-מודולטוריים על בסיס מעורבות מטרה מאושרת בהקשרים של וירוסים פתוגניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית, צביעה אימונופלורסצנטית וטכניקות וירולוגיה התואמות את רמת הבטיחות הביולוגית.
- תלוי בגישה לנוגדנים בעלי רגישות גבוהה ל-dsRNA (למשל, clone 9D5) ותשתית דימוי פלואורסצנטית תואמת.
- מחייב סטנדרטיזציה בין מעבדות לצורך כימות עקבי של אות ה-dsRNA וניתוח קולוקליזציה.
- יש להתחשב בשונות בין מודלים תאיים (למשל, A549 לעומת אפיתל דרכי נשימה ראשוני) ברמות ייצור ה-dsRNA וביטוי PRR.
- מגבלות מעשיות כוללות תגובתיות-צולבת פוטנציאלית של נוגדנים והצורך באופטימיזציה בסביבות בעלות רמת בידוד גבוהה (BSL-3/BSL-4).
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
