אור מונחה אנזימתי Decarboxylation

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להניע תגובות אנזימטיות באמצעות אור נראה. בגישה זו, אור משמש להמרת חומצות שומן לאלקינים סופניים בתנאי תגובה מתונים. דה-קרבוקסילציה דורשת שבירת קשרי CC.

והקשר הזה יציב מאוד, מה שהופך את זה לתגובה קשה מאוד. השימוש באור הוא גישה בת קיימא להשגת תגובה כה קשה. הרעיון לשיטה הזו עלה לראשונה כשניסינו להוסיף מי חמצן ישירות לתגובה, מה שהוביל להשבתת האנזימים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת כמות קבועה של מי חמצן. ראשית השתמשנו ב-OleT מטוהר לביוקטליזה מונעת אור כדי לאפיין את האנזים שלנו. מאוחר יותר בדקנו גם תמצית גולמית שתהיה חשובה לפיתוח יישומים תעשייתיים.

לאחר שיבוט הגן הסינתטי OleT לווקטור הביטוי והפיכת הפלסמיד ל-E.Coli כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש לחסן את התאים בשתי מבחנות המכילות שלושה מיליליטר של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. דגרו את התרביות המוקדמות בשייקר למשך 15 שעות. מדללים שני מיליליטר מהתרבות ל -200 מיליליטר LB עם אמפיצילין בשתי צלוחיות של ליטר אחד.

דגרו את הצלוחיות בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד עד שהתרביות מגיעות לצפיפות אופטית של 600 ננומטר בין 0.6 ל-0.8. לאחר מכן, הוסף 0.5 מילימולר של חומצה דלתא אמינולוולינית לתרבויות. ואז לגרום לתאים על ידי הוספת טטרציקלין ב-0.2 מיקרוגרם למיליליטר לצלוחיות.

דגרו על התרביות למשך 15 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד. לאחר האינדוקציה, שפכו את התרביות לצינורות צנטריפוגה וצנטריפוגות את הצינורות ב-12000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הכדורים על ידי פיפטינג ב-50 מיליליטר של מאגר טריס קר כקרח והעבירו את המתלה לצינור צנטריפוגה חרוטי. המשיכו בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש כל כדור בשלושה מיליליטר של חיץ על ידי פיפטינג חוזר.

לייז את התאים על ידי סוניקציה עם שלושה מחזורים של 30 שניות תוך השהיה למשך דקה אחת בין מחזורים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הליזאט ב-15000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן פיפטה בזהירות את התמצית החופשית של התאים לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטיים. להכנת התמצית הגולמית לביוקטליזה מונעת אור, העבירו שלושה מיליליטר של תמצית חופשית תא אחד למסנן צנטריפוגה של 10 קילודלטון וצנטריפוגה ב-4000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר מולקולות קטנות.

השעו מחדש את החלבון בשלושה מיליליטר טריס. כדי לאפיין את הפעילות של OleT בביוקטליזה מונעת אור, יש לטהר את החלבון. כדי להתחיל בטיהור חלבון, טען שלושה מיליליטר של תמצית ללא תאים על עמודות ספין ניקל NTA מאוזנות.

אטום את העמודים עם תקעים תחתונים ומכסי ברגים. ומנערים אותם קלות עד שהשרף מתפזר באופן שווה. המשך על ידי דגירה של העמודים בשייקר תקורה.

ואז צנטריפוגה את העמוד. לאחר מכן, שטפו את העמודים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר כביסה וצנטריפוגה בטמפרטורה של 700 פעמים G למשך שתי דקות. חזור על הכביסה פעמיים נוספות.

לאחר הכביסה, הניחו את העמודים בצינורות צנטריפוגה חרוטיים והוסיפו מיליליטר אחד של מאגר פליטה לכל עמודה. צנטריפוגה את הצינורות ב-700 פעמים G למשך שתי דקות וחזור על הפליטה פעמיים נוספות. הוסף את תמציות העמודות המשולבות למסנן צנטריפוגה של 10 קילודלטון וצנטריפוגה אותו ב-4000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד את האימידזול המשמש לפליטה מהאנזים.

לבסוף קבע את טוהר החלבון וריכוזו כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל בהליך הטרנספורמציה הביולוגית, הוסף תחילה 10% של חומר פעילי שטח כגון טרגיטול ו-28.4 מיליגרם של חומצה סטארית למים מזוקקים כדי ליצור 10 מיליליטר של תמיסת מלאי של 10 מילי-מולאר. מחממים את התמיסה בתא חימום, בחום של 60 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה של החומצה הסטארית

השתמש בתמיסה זו להכנת תערובת תגובה לפי הפרוטוקול הבא. הוסיפו FMN, EDTA, חוצץ וחומצה סטארית לשני צינורות זכוכית שקופים וערבבו באמבט מים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. המשך על ידי הוספת 200 מיקרוגרם למיליליטר של האנזים המטוהר או התמצית הגולמית לשפופרות.

והאירו אותם בנורת לד שקופה במרחק של שני סנטימטרים. לאחר מכן, קח 200 דגימות מיקרוליטר בנקודות זמן ספציפיות בצינורות מלאים מראש ב-20 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית 37% כדי לעצור את התגובות. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטרים של תמיסת חומצה מיריסטית של 10 מילי-מולרית לכל דגימה כסטנדרט פנימי.

כדי לנתח את תוצרי התגובה, הוסף פעמיים 500 מיקרוליטר אתיל אצטט לצינורות. הפוך את הצינורות כדי לערבב אותם וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב -13,000 פעמים G.לאחר מכן, העבירו 400 מיקרוליטר של הסופרנטנטים לצינורות מיקרו צנטריפוגות ואידוי אותם לחלוטין על ידי נשיפה עדינה על הצינורות עם אוויר דחוס. הוסף 200 מיקרוליטר MSTFA לצינורות.

ודגרו את התערובת בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לגזור את הדגימות לפני הניתוח. נתח את תוצרי התגובה על ידי הזרקת דגימה של ארבעה מיקרוליטר לכרומטוגרף גז המצויד בגלאי יינון להבה באמצעות פרופיל הטמפרטורה המתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, קבע את היחס בין הפטדקאן אחד וחומצה בטא הידרוקסית שנוצרה בכל דגימת תגובה עם כרומטוגרף גז יחד עם ספקטרומטר מסה.

השתמש בהגדרות טמפרטורת התנור וספקטרומטר המסה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הזריק מיקרוליטר אחד מכל דגימה לתוך כרומטוגרף הגז ורשום את הכרומטוגרמה. לבסוף, עקוב אחר כרומטוגרמות ה-GCMS עבור כל דגימה ונתח אותן בהתאם לפרוטוקול היצרן.

המשקלים המולקולריים של התוצרים מהתגובות האנזימטיות נקבעו באמצעות כרומטוגרף גז המחובר לספקטרומטר מסה. עבור חומצות שומן עם שרשראות אציל ארוכות יותר, האנזים OleT, מזרז באופן מועדף את הדקרבוקסילציה שלהן לאולפינים באורכים שונים. דגימות מתגובת הטרנספורמציה הביולוגית נותחו על ידי כרומטוגרף גז המצויד בגלאי יינון להבה.

הוכח כי דה-קרבוקסילציה של החומצה הסטארית מתרחשת פי שלושה מהר יותר מתגובת ההידרוקסילציה, כאשר 99% מהחומצה הסטארית מומרת לתערובת של 3.3:1 של הפטדקאן אחד לחומצה סטארית 2-הידרוקסית. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הביוקטליזה המונעת על ידי אור תוך מספר שעות אם נניח שאני מתפקד כראוי. בקטליזה של אור, האתגר הוא לקשר בין תגובות שימושיות לקצירת האור.

במקרה שלנו, יש לנו את האור בתוך המולקולה FMN כרגיש לאור ומקשר אותם לאנזים שלנו באמצעות מולקולת העברה שהיא מי חמצן.