הודעת הטור derivatization שימוש ביצועים גבוהים תזרים תגובת עמודות נוזלת כרומטוגרפיה
26 באפריל 2016
מוצג פרוטוקול לשימוש בעמודות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים של זרימת תגובה לשיטות המשתמשות בנגזרת פוסט עמודה (PCD).
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשפר את היעילות והרגישות של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים לאחר נגזרת עמודה, או שיטת PCD, באמצעות שימוש בעמודת זרימת תגובה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים כמו מדעי התרופות, הביו-רפואה והסביבה, שבהם מנותחים תרכובות בעלות תגובה נמוכה לגלאי HPLC. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאין צורך בסלילי תגובה.
מכיוון שערבוב של שפכי העמודה ומגיב נגזרת מתרחש בצורה יעילה יותר משיטות קונבנציונליות. שיטה זו שימשה כדי לספק תובנות לגבי נוגדי חמצון, חומצות אמינו ופנולים. ניתן ליישם אותו גם על תרכובות מסוג אחר, כגון תיולים, מתכות, אנטיביוטיקה ורעלים.
למרות שהמדגם כולו אינו נגזר, עקב הרחבת פס נמוך יותר, ריכוז האנליט בזרם זרימת הקולחין גבוה יותר מאשר בניתוח נגזרת פוסט עמודה קונבנציונלי. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מכשיר ה-HPLC עם 100% מים בקו A ו-100% מתנול בקו B כשלב הנייד, תוך טיהור המשאבות בהתאם לדרישות היצרן. הגדר את הרכיבים האינסטרומנטליים של HPLC ואת משאבת הנגזרת הנוספת.
לאחר מכן, הגדר את גלאי ה-UV/VIS לניתוח באורך גל של 520 ננומטר. חבר את הכניסה של עמודת זרימת התגובה, או RF, למכשיר HPLC. חבר יציאה היקפית לשקע לגלאי UV/VIS באמצעות צינור באורך 15 ס"מ בקוטר פנימי של 0.13 מילימטר.
לאחר מכן, חבר את קו משאבת ה-DPPH ליציאה היקפית בשקע עמוד ה-RF. חסום את היציאה ההיקפית שאינה בשימוש ביציאה של עמוד ה-RF באמצעות פקק עמוד. חבר צינור באורך 15 ס"מ בקוטר פנימי של 0.13 מילימטר ליציאה המרכזית של עמוד ה-RF.
הביאו את קצב הזרימה של משאבת ה-HPLC למילימטר אחד לדקה ב-100% מתנול. לאחר מכן אזנו את העמודה עם 100% מתנול למשך 10 דקות. בשלב זה, הכינו תמיסה של 0.1 מיליגרם למיליליטר של DPPH ומתנול.
סוניקציה של הבקבוק המכיל את מגיב ה-DPPH למשך 10 דקות. נקה את משאבת ה-DPPH עם מגיב ה-DPPH המוכן בהתאם לדרישות היצרן. לאחר מכן, קחו שני כלים יבשים ונקיים וסמנו אחד כמרכזי והשני כהיקפי"שקלו במדויק את שני הכלים.
אסוף את השפכים היוצאים מהנמל המרכזי לכלי המסומן "מרכזי" למשך דקה אחת. לאחר שקילה מחדש של כלי הנמל המרכזי, חשב את משקל הזרימה מהנמל המרכזי. חזור על השלבים הקודמים עבור הקולחין היוצא מה-UV/VIS המחובר ליציאה ההיקפית של עמודת ה-RF.
חשב את המשקל עבור כלי הנמל ההיקפי. לאחר מכן, חשב את אחוז הזרימה המגיעה מהנמלים המרכזיים וההיקפיים. חזור על השלבים הקודמים עד שיחס הזרימה נכון, ולאחר מכן הגדר את קצב הזרימה של משאבת DPPH ל-0.5 מיליליטר לדקה.
לאחר סיום הריצה, הפסק את זרימת משאבת המגיב הנגזרת. הסר את קו משאבת המגיב DPPH מהיציאה ההיקפית ועצור את היציאה. אזנו את העמודה עם השלב הנייד בו היא מיוחסנת, ואפשרו לשלב הנייד לעבור דרך העמודה במהירות של מילימטר לדקה למשך 10 דקות.
לאחר מכן, עצור את זרימת משאבת שלב הבועות במכשיר ה-HPLC. לבסוף, החלף את מגיב ה-DPPH במתנול וטהר את המשאבה הנוספת. שתי כרומטוגרמות של דגימת קפה ריסטרטו, שנגזרו עם רדיקל DPPH באמצעות מכשור PCD ו-RF-PCD קונבנציונלי, מוצגות כאן.
הגבולות המחושבים של כימות וזיהוי עבור כל אחת מחומצות האמינו שנותחו הן במצבי RF-PCD והן במצבי PCD קונבנציונליים מפורטים כאן. כרומטוגרמה של ארבע חומצות האמינו שנותחו בשיטת PCD הקונבנציונלית, שיטת RF-PCD והזרם הלא נגזר משיטת RF-PCD מוצגת כאן. השוואה של האותות המתקבלים עבור הפסגות עקב גליצין ולאוצין באמצעות שיטות PCD ו-RF-PCD הקונבנציונליות מוצגת כאן.
השוואה של רוחב השיא של שיא הטריפטופן בעת ניתוח בשיטת PCD קונבנציונלית, שיטת RF-PCD והזרם הלא נגזר משיטת RF-PCD מוצגת כאן. מדגם בדיקה בן 21 רכיבים שהכיל כמה רכיבים המראים תגובה לסכימת הנגזרת וחלקם לא הופרדו, נגזרו וזוהו. אותה תערובת הופרדה גם היא והתגלתה ללא נגזרת להשוואה.
השוואה של צורת השיא של para-Cresol, שניהם נגזרים באמצעות העמודה RF-PCD ולא נגזרים, מוצגת כאן. לאחר שליטה, ניתן להגדיר טכניקה זו במקביל לניתוח נגזרות פוסט עמודות קונבנציונאלי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות קרוב ככל האפשר ליחסי הזרימה שנקבעו.
בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בריאגנטים אחרים לנגזרת לאחר עמודה, כגון OPA, נינהידרין או הלוגנים על מנת לנתח תרכובות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד להגדיר ולכוון עמודת זרימת תגובה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לשיפור היעילות והרגישות של נגזרת לאחר עמודה (PCD) בכרומטוגרפיה נוזלית בעלי ביצועים גבוהים (HPLC) באמצעות עמודי זרימה לתגובה. שיטה זו שימושית במיוחד בניתוח תרכובים בעלי תגובה נמוכה לגלאי HPLC בתחומי מדע שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי הרוקחות
- מדעי הביו-רפואה
- מדעי הסביבה
רקע
- כרומטוגרפיה נוזלית בעירה גבוהה (HPLC) נמצאת בשימוש נרחב לניתוח תרכובים.
- נגזרת לאחר עמודה (Post column derivatization) משפרת את רגישות הגילוי.
- שיטות קונבנציונליות דורשות לעיתים קרובות סלילי תגובה, שאתם שיטה זו מבטלת.
- השיטה מאפשרת ערבוב יעיל של תפליטי העמודה והריאגנטים.
מטרת המחקר
- לשיפור היעילות של שיטות HPLC PCD.
- לניתוח תרכובות בעלות תגובה נמוכה של הגלאי.
- למתן תובנות לגבי מחלקות שונות של תרכובות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בעמודות כרומטוגרפיה נוזלית בעומדן גבוה (HPLC) מזרימה של תגובה.
- טכניקות של נגזרת לאחר עמודה.
- ניתוח של נוגדי חמצון, חומצות אמינו ופנולים.
- יישום עבור תיולים, מתכות, אנטיביוטיקה ורעלים.
תוצאות עיקריות
- שיפור ביעילות וברגישות של זיהוי תרכובות.
- ביטול סלילי התגובה משפר את ביצועי השיטה.
- יישום מוצלח על פני מספר מחלקות של תרכובות.
- השגת תובנות לגבי אינטראקציות ביוכימיות מורכבות.
מסקנות
- שיטת עמודת זרימת התגובה משפרת באופן משמעותי את ה-HPLC PCD.
- טכניקה זו היא ורסטילית עבור יישומים מדעיים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את השימוש בה בתחומים אנליטיים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
נגזרת לאחר העמודה (PCD) משפרת את רגישות הגילוי עבור אנליטים בעלי תגובה נמוכה במחקרים פרמצבטיים וביו-רפואיים, אך שיטות קונבנציונליות סובלות מהרחבת פס בשל סלילי תגובה גדולים. PCD בזרימת תגובה (RF-PCD) מבטלת מגבלה זו על ידי אפשור ערבוב יעיל בתוך העמודה, מה שמשפר את יעילות ההפרדה ואת יחס האות לרעש. התקדמות זו תומכת בכימות מהימן של תרכובות כגון חומצות אמינו, נוגדי חמצון ופנולים, ומשפיעה ישירות על רגישות הבדיקה בתהליכי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר זיהוי של אנליטים ללא נגזרות מהפתח המרכזי, דבר המאפשר ניטור מקבילי של מינים טבעיים ומינים שעברו שינוי לצורך הבנה מכניסטית.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בסלילי תגובה, ובכך מפחית את הנפח המת של המערה וממזער את התרחבות הפס כדי לשמור על הרזולוציה הכרומטוגרפית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: משפר את יחס האות לרעש עבור תרכובים בריכוז נמוך, ובכך משפר את גבולות הגילוי במבדקי נוגדי חמצון, חומצות אמינו ופנולים.
- ערך תפעולי: משתמש ברכיבי HPLC סטנדרטיים עם משאבת דרביזציה, מה שמאפשר שילוב פשוט בפלטפורמות אנליטיות קיימות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בניתוח של מחלקות תרכובים מגוונות, כולל תיולים, מתכות, אנטיביוטיקה ורעלים, ובכך מרחיב את היישום במחקרי בטיחות ואפיון מטבוליטים.
- ערך תפעולי: שומר על תאימות לגילוי UV/VIS באורך גל של 520 nm, מה שמאפשר אימוץ חלק ללא צורך בציוד חדש.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת RF-PCD משתלבת ברצף הגילוי על ידי שיפור אמינות הזיהוי בסריקות שלבים מוקדמים, שבהן כימות רגיש של תרכובים ביו-אקטיביים מסייע בזיהוי ותעדוף של מולקולות מובילות (leads).
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): מגבירה את הביטחון בזיהוי של מטאבוליטים וביומארקרים בעלי תגובה נמוכה על ידי שיפור הרגישות האנליטית ללא חסרונות של תהליכי נגזרת (derivatization).
- סריקה (Screening): מספקת תוצאים כמותיים וניתנים לשחזור באמצעות נפח תגובה מינימלי וערבוב יעיל, ובכך תומכת בהערכת תרכובות בסריקות שthroughput גבוה.
- אנליטיקה (Analytics): מאפשרת השוואה ישירה בין זרמי דגימות עם נגזרת וללא נגזרת, ומספקת בקרות פנימיות לתיקוף הבדיקה ולנורמליזציה של נתונים.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מקלה על ניטור רציף של אנליטים משלב הגילוי ועד למחקרים פרה-קליניים, על ידי שמירה על שלמות האנליט ודיוק הזיהוי.
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): מנצלת את תשתית ה-HPLC הקיימת בתוספת מינימלית של מורכבות, ובכך מקדמת סטנדרדאציה בין-מחלקתית ויכולת ניידות של שיטות העבודה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בזיהוי האנליט על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות הנובעות מחוסר רגישות ושיפור בהירות האות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות ואת יכולת ההרחבה על ידי ביטול השונות הקשורה להכנת סליל התגובה וליעילות הערבוב.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות go/no-go טובות יותר באופטימיזציה של מובילים (lead optimization) על ידי אספקת נתונים מדויקים יותר על קשר מבנה-פעילות המתבססים על זיהוי רגיש.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מועמדים מותאם סיכונים על ידי שיפור איכות הנתונים במבדקי סריקה מוקדמים של ADME ורעילות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפיתוח שיטות HPLC ובאופטימיזציה של קצב הזרימה כדי לאזן בין זרימת ריאגנט הגזירה לזרימת הפאזה הניידת.
- דורש משאבת גזירה ייעודית וצינורות תואמים (0.13 mm ID) להגשה מדויקת של הריאגנט ליציאות הפריפריאליות.
- מחייב סטנדרטיזציה של יחסי הזרימה בין היציאות המרכזיות לפריפריאליות כדי להבטיח יעילות גזירה עקבית בין הרצות שונות.
- כולל תחזוקה שוטפת, כגון שלבי שטיפה (purging) והשחלה (equilibration), למניעת שאריות ריאגנטים ולהבטחת יציבות העמודה.
- מוגבל לתגובות גזירה בעלות רכיב אחד או שניים, כאשר ניתן להוביל את שני הריאגנטים בו-זמנית דרך היציאות הפריפריאליות.
