אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות גנים מועמדים חדשים להפרעות מום במוח ולאשר ישירות את תפקידם הסיבתי in vivo. אסטרטגיה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה על ידי גילוי מסלולים מולקולריים הקשורים להתפתחות המוח ופתולוגיות מתואמות. היתרון העיקרי של אסטרטגיה זו הוא שהיא תסייע בגילוי גנים חדשים הקשורים להפרעות מוחיות ובפיתוח כלי אבחון חדשים.

באמצעות גישה זו יכולנו לחשוף את התרומה המכרעת של הגן C6orf70 בפתוגנזה של הטרוטופיה נודולרית סביב החדר, מום מוחי הנגרם על ידי נדידה עצבית לא תקינה. תדגים את ההליך פביאן שאלר, מהנדסת מהמעבדה שלנו. להכין חולדה בהריון E15 להליך כמפורט בפרוטוקול הכתוב ובהתאם להנחיות המוסדיות והלאומיות.

יש לוודא כי בעל החיים מורדם כראוי, שמורחים משחה עיניים על העיניים וכי הבטן מגולחת ומחוטאת כראוי. לאחר שימוש במספריים חדים לביצוע חתך אנכי של שני סנטימטרים בעור ובשריר קו האמצע של בטן הזנב, חשוף בזהירות קרן רחם אחת מחלל הבטן. יש למרוח תמיסת מלח רגילה מחוממת מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להעניק לחות לעוברים.

שמור על הרחם לח לאורך כל ההליך. כדי להזריק DNA, החזיקו בעדינות עובר ביד אחת כשהראש נגיש בקלות. לאחר מכן, בעזרת היד השנייה, הכנס בזהירות נימי זכוכית המחוברים למיקרו-מזרק לחדר הצדדי השמאלי שנמצא מילימטר אחד מקו האמצע ובעומק של שניים עד שלושה מילימטרים.

השתמש במיקרו-מזרק כדי להזריק כמיקרוליטר אחד של DNA עם ירוק מהיר כדי לאפשר ניטור חזותי של ההזרקה. כדי לאלקטרופורציה של ה-DNA לתוך התאים, זרוק תחילה תמיסת מלח רגילה על פני האלקטרודה בגודל שלושה על שבעה מילימטרים. לאחר מכן הנח את האלקטרודה החיובית בצד המוזרק ואת האלקטרודה השלילית בחדר הימני הלא מוזרק.

השתמש בדוושה הנשלטת על ידי כף הרגל כדי לספק חמישה פולסים חשמליים במרווחים של 950 אלפיות השנייה. לאחר האלקטרופורציה, החזירו את קרן הרחם לחלל הבטן והוסיפו מי מלח סטריליים כדי לאפשר לעוברים להתמקם באופן טבעי יותר וכדי להסביר את אובדן הנוזלים תוך הניתוח. סגור את דופן השריר בתפרים כירורגיים נספגים, ולאחר מכן את העור באמצעות תפר קטוע פשוט.

לספק משככי כאבים לאחר הניתוח עד 48 שעות או כפי שמצוין בהנחיות המוסדיות. החזירו את החולדה לכלוב הביתי הנקי שלה ועקבו אחריה עד שתצא מההרדמה. לאחר קיבוע המוח ב-4% פרפורמלדהיד כמתואר בחלק הכתוב של הפרוטוקול, יש לשטוף ב-PBS למשך 10 דקות.

בזמן הכביסה הכינו 50 מיליליטר של 4% אגר ב- PBS ווודאו כי טמפרטורת האגרוז המומסת לא תעלה על 50 מעלות צלזיוס. יוצקים את האגרוז לתבניות הטמעה מפלסטיק ואז מניחים את המוח באגרוז. מקם את המוחות המוטבעים בארבע מעלות צלזיוס ואפשר לאגרוז להתפלמר למשך שעה לפחות.

לאחר שהאגרוז עבר פולימריזציה, חתוך את עודפי האגרוז מסביב למוח, הדביקו את המוח ללוחית הבסיס של הוויברטום עם הגישה האחורית הקדמית של המוח בניצב ללהב. לאחר המתנה של מספר דקות לייבוש הדבק, הניחו את הצלחת עם המוח המודבק לתוך תא הרטט. מלאו את הוויברטומה ב-PBS והתחילו לחתוך חלקים בעובי 100 מיקרון.

לאחר החיתוך, העבירו את החלקים לשקופיות מיקרוסקופ והסירו עודפי נוזלים. לאחר מכן הוסף כמה טיפות של מדיום הרכבה והניח החלקת כיסוי על גבי החלקים. יש להניח לייבוש למשך הלילה.

צלם את החלקים באמצעות הגדלה פי 10 במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר. כדי לנתח את התמונות, המר תחילה את התמונה ב-8 סיביות באמצעות תוכנה מתאימה לניתוח תמונה כמותית. לאחר מכן בחר תא פלואורסצנטי חיובי GFP מייצג אחד והגדר את צורתו באופן ידני על ידי לחיצה על אומדן ושימוש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לצייר את גבול התא.

התוכנה שומרת אוטומטית על הקוטר וסף העוצמה של התא. לחץ על מצא תאים כדי לאפשר לתוכנה למקם תאים שעברו טרנספטציה ברחבי קליפת המוח. לאחר מכן, במידת הצורך, הסר באופן ידני תוצאות חיוביות מוטעות.

חלקו את כל עובי קליפת המוח לשמונה אזורי עניין, מנורמלים בקטעים בודדים, על ידי לחיצה על כלי האזור, בחירת שמונה פסי אזור, כאשר הפסים 1 ו-8 מתאימים לאזור החדר ולחלק העליון של צלחת קליפת המוח בהתאמה. לאחר מכן, לחץ על החל כדי לאפשר לתוכנה לספור את המיקום היחסי של תאים שעברו טרנספטציה של GFP בכל קליפת המוח. לבסוף, לחץ על שמירת כימות כדי לייצא נתונים בקובץ אקסל לניתוח.

מערך CGH וריצוף אקסום שלם זיהו את C6orf70 כגן מועמד להפרעות בגנים התפתחותיים. PCR כמותי קבע כי גן זה, יחד עם PHF10 ו-DLL1 מתבטאים בקליפת המוח של חולדות. התמונות הבאות מציגות חלקים עטרתיים ניאו-קורטיקליים מייצגים של מוחות חולדות E20 5 ימים לאחר אלקטרופורציה עם מבנה חלבון פלואורסצנטי ירוק בלבד או בשילוב עם shRNA המכוון לרצף הקידוד C6orf70 או עם מבנה אי ההתאמה הלא יעיל יחסית.

נימה A נוק דאון שימש כבקרה על נדידת עצבים לקויה. אלקטרופורציה תוך רחמית עם shRNA המכוון ל-C6orf70 או נימה A גרמה לעצירת תאים חיוביים של GFP בתוך אזור החדר כפי שמצוין על ידי החצים הלבנים, בעוד שהתאים המבטאים GFP לבד, או בשילוב עם מבנה חוסר ההתאמה לא שינו את הנדידה העצבית. בעת ניסיון הליך זה חשוב לקחת בחשבון איזה מצב של התהוות קליפת המוח אתה רוצה לנתח, או התפשטות עצבית, נדידה או התבגרות.

אל תשכח שלימוד ביצוע אלקטרופורציה תוך רחמית במוח עוברי של מכרסמים דורש תקופת הכשרה ארוכה, מיומנויות ותרגול קבוע.