שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לטהר תאי אנדודרמיס הנוצרים מתאי גזע עובריים אנושיים או תאי ES. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע לגבי התמיינות אנדודרמיס. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שניתן להשיג אוכלוסיית תאי אנדודרם טהורה לאחר הסרת תאים לא מובחנים.

לפני תחילת ההליך, יש לצפות שש צלחות תרבית תאי באר במיליליטר אחד של מטריצת קרום מרתף לכל באר. למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, כדי לקצור את תאי ה-ES האנושיים, שאפו את המדיום מתרבית תאי גזע עובריים אנושיים של 80 עד 90% עם פיפטת מרעה סטרילית מזכוכית

ושוטפים את התאים בשני מיליליטר PBS לבאר. ניעור הצלחת ושאיבת מי המלח כדי להסיר את התאים המתים והפסולת. לאחר מכן, נתקו בעדינות את אשכולות התאים עם מיליליטר אחד של מגיב תמיסת מעבר נטול אנזימים, ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד שהתאים מראים סימנים ברורים של שיבוש לאשכולות קטנים יותר.

לאחר כשבע דקות, הוסף מיליליטר אחד של מדיום DMMF12 לבארות. ופיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי לנתק את אגרגטי התאים הנותרים לתרחיף תא בודד. בעזרת אותה פיפטה, העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה ושטפו את הבארות במיליליטר אחד של מדיום DMMF12 טרי, ואגדו את השטיפות בצינור.

לאחר סיבוב התאים, השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאי ES בתוספת מעכב ROCK. ספרו את התאים והזרעים 1.5:4 כפול 10 עד התאים החמישיים לבאר על צלחות מצופות מטריצת קרום הבסיס במדיום תרבית בתוספת מעכב ROCK למניעת אפופטוזיס. דגרו על התאים למשך כ- 24 שעות.

ואז השתמש בפיפטה סטרילית מזכוכית פסטר כדי להחליף את המדיום בכל באר ב -2 מיליליטר של מדיום אינדוקציה פס פרימיטיבי. לאחר 24 שעות נוספות של תרבית, החלף את המדיום במדיום אינדוקציה אנדודרמי למשך 48 שעות דגירה עם החלפות מדיום יומיות. ביום האחרון של התרבית ולפחות שעה לפני קצירת התאים, הוסף מעכב ROCK טרי למדיום התרבית.

לאחר מכן השתמש בפיפטה סטרילית מזכוכית פסטר כדי לשאוב את המדיום מכל אחת מהבארות ולנתק את התאים עם מגיב תמיסת מעבר נטול אנזימים כפי שהודגם זה עתה. כאשר הושגה תרחיף של תא בודד, ספור את התאים וצנטריפוגה אותם. ודא שמנקודה זו ואילך, כל המדיום והמאגרים מכילים את מעכב ה-ROCK כדי למנוע מהתאים למות.

אחרת, הם לא יחוברו כראוי לאחר הנסיגה. השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר PEB, בתוספת מעכב ROCK לכל 1 כפול 10 לתאים השביעיים. לאחר מכן הוסף נוגדן CXCR4 APC לתאים.

העבירו בעדינות את הצינור כדי לערבב. לאחר 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, שטפו את התאים במיליליטר אחד עד שניים של מאגר PEB והשתמשו בפיפטה סטרילית מזכוכית פסטר כדי לשאוב את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב-80 מיקרוליטר של מאגר PEB לכל 1 כפול 10 לתאים השביעיים והוסיפו 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד APC לתאים.

מערבבים את הדגימה בתנועה עדינה. לאחר מכן דגרו על התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים עם מיליליטר עד שניים של מאגר PEB בתוספת מעכב ROCK.

ולהשעות מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר PEB טרי בתוספת מעכב. כדי לבודד את תאי CXCR4+ על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים, טען עמודה מגנטית בגודל בינוני על מגנט בגודל מתאים ושטוף מראש את העמודה עם מאגר PEB של 500 מיקרוליטר בתוספת מעכב ROCK. כאשר כל הכביסה התנקזה מראש העמוד, החל את כל נפח התא המסומן בחרוז מגנטי על העמודה, ואסוף את הזרימה בצינור חרוטי.

שטפו את העמודה בשלושה יישומים של 500 מיקרוליטר של מאגר PEB בתוספת מעכב ROCK. לאחר מכן העבירו את העמוד מהמגנט לצינור איסוף מתאים. וצלול מיליליטר אחד של מאגר PEB בתוספת מעכב ROCK דרך העמודה כדי לאסוף את תאי CXCR4+.

לחלופין, ניתן לאסוף את כל הזרימה דרך דגימות בנפרד ולהשתמש ב-20 מיקרוליטר מכל דגימה כדי לקבוע את אחוז תאי CXCR4+בכל אלואטה על ידי ציטומטריית זרימה. ניתן לחזור על הליך זה עם הזרימה הראשונה לאיסוף תאים שלא נקשרו לעמודה. לאחר מכן אסוף את שתי דגימות CXCR4+ הכל וצנטריפוגה אותן.

לבסוף, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה אנדודרם בתוספת מעכב ROCK וזרעו את התאים בצפיפות המתאימה במיכל תרבית תאים מצופה מטריצת קרום מרתף. לפני ההתמיינות שלהם, תאי ES אנושיים מבטאים רמות גבוהות של סמן הפלוריפוטנטיות SOX2. ואילו סמן האנדודרם הסופי, FOXA2 אינו מזוהה.

עם ההתמיינות, תאי ה-ES עוברים שינויים דרסטיים בביטוי הגנים והחלבונים שלהם. ואכן, לאחר ארבעה ימים במדיום התמיינות, SOX17 ו-FOXA2 מתבטאים באופן אחיד בתוך הגרעינים של רבים מתאי ה-ES לשעבר, סימן היכר של מחויבות אנדודרמית מוחלטת. חלק מהתאים מתנגדים לתהליך ההתמיינות, ומבטאים אף אחד משני חלבוני הסמן.

ולמעשה, לשמור על ביטוי SOX2 של סמן הפלוריפוטנטיות שלהם. בניסוי מייצג זה, ביום השלישי של ההתמיינות, כמעט 60% מתאי ה-ES שנקטפו ביטאו CXCR4, שהטוהר שלו הועשר ליותר מ-85% לאחר מיון חרוזים מגנטיים של תאי השושלת הפלוריפוטנטיים ותאי שושלת לא רצויים אחרים. לאחר זריעת תאי CXCR4+ המטוהרים, מתגלים רק כמה תאי SOX2+, כאשר רוב התאים הזרעים מבטאים FOXA2.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים, אם מבוצעת כראוי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע היסטוכימיה חיסונית אחרת או QPCR כדי לענות על שאלות נוספות לגבי תהליך ההתמיינות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר תאי אנדודרם על ידי מיון חרוזים מגנטיים.