באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS
15 בפברואר 2016
עבודה זו מציג פרוטוקול טיפול נוזל וההכנסה מדגם על microchannel עבור באתרו זמן של טיסת ניתוח ספקטרומטריית משני יון המוני של ביומולקולות חלבון בתמיסה מימית.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפיין שכבות חלבון ספח בתוך תמיסות מימיות, תוך שימוש במערכת לניתוח בממשק נוזל-ואקום (System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface) ובספקטרומטריית מסות של יוני משניים בזמן מעוף (time-of-flight secondary ion mass spectrometry). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע למולקולות ביולוגיות ולממשק הביולוגי. לדוגמה, אפיון של חלבונים ספוחים על פני שטח מוצק.
היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן להתחיל את הטיפול בביומולקולות in situ בסביבה נוזלית, ובשילוב עם מיפוי מולקולרי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביומולקולות בממשק מוצק-נוזל, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כולל חקירה של תאי סרטן בודדים, אינטראקציות של תרופות והיצמדות של ביופילמים. שאבו למזרק של 5 mL נפח של 2 mL של תמיסת 70% ethanol.
חברו את המזרק לקצה הכניסה של מכשיר ה-SALVI, והזריקו לאט מיליליטר אחד של הנוזל לאורך 10 דקות. בסיום ההזרקה, הסירו את המזרק וחברו את הכניסה והיציאה של ה-SALVI באמצעות מחבר polyether-ether-ketone. השאירו את המיקרו-תעלה של ה-SALVI מלאה בתמיסת 70%ethanol בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.
לאחר מכן, מלאו מזרק שני במים דה-יוניים סטריליים. חברו אותו לכניסה של ה-SALVI והזריקו לאט את המים הדה-יוניים אל תוך המכשיר לאורך 10 דקות. הסירו את המזרק וחברו מחדש את הכניסה והיציאה של המכשיר זו לזו.
כדי לקבע שכבת חלבון, התחילו בשאיבת 2 mL של תמיסת פיברונקטין למזרק. חברו את המזרק לכניסה של מכשיר ה-SALVI, והזרימו באיטיות 1 mL של הנוזל לאורך 10 דקות. לאחר מכן, הסירו את המזרק וחברו מחדש את הכניסה והיציאה.
דגרו את המערך בצלחת תרבית נקייה בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות. לאחר הדגירה, הזריקו לאט 1 mL של מים סטריליים דאיוניים לאורך 10 דקות, ולאחר מכן חברו מחדש את פתח הכניסה לפתח היציאה. להתחלה, הניחו את במת ה-ToF-SIMS על משטח שטוח ונקי.
הניחו את מכשיר ה-SALVI על הבמה כאשר פרוסת הסיליקון וממברנת הסיליקון ניטריד פונות כלפי מעלה. קבעו את מכשיר ה-SALVI לבמה באמצעות ארבעה תפסני מתכת, והבריגו את חלקי המתכת המחזיקים את פינות המכשיר אל לוח המתכת באמצעות ארבעה ברגים. לאחר מכן, גלגלו בעדינות את צינור ה-PFTE המחובר לערוץ המיקרופלואידי.
השתמש בארבעה חלקי מתכת ובארבעה ברגים כדי לקבע את החלק הקשיח. ודא שהמכשיר ממוקם בשטח הפתוח שעל הבמה, כך שלא יפריע לאלומה הראשית של היונים במהלך הניתוח. לאחר מכן, הרכב את כוס פראדיי (Faraday cup) על הבמה באמצעות בורג.
לאחר מכן, פתח את דלת תא ההעמסה (loadlock) של ה-ToF-SIMS והנח את הבמה באופן אופקי על פלטפורמת ההעמסה לפני סגירת הדלת. הפעל את משאבת הוואקום והמתן עד שפנימיות תא ההעמסה תגיע לריק של כ-10⁻⁶ millibar. לאחר כ-30 דקות, ברגע שהוואקום התייצב, העבר את מכשיר ה-SALVI אל התא הראשי.
כווננו את קרן היונים הראשונית ואת האנלייזר של ה-ToF-SIMS כדי להשיג רזולוציה מרחבית של כ-400 ננומטר, וזאת בהתאם לפרוטוקול המומלץ על ידי היצרן. לאחר מכן, אתרו את התעלה המיקרופלואידית באמצעות המיקרוסקופ האופטי. השתמשו במרכז התמונה האופטית כנקודת ייחוס, וכווננו אותו כך שיהיה תואם למרכז תמונת היונים המשניים.
הדגמה חזותית של שלב זה היא קריטית, שכן קשה ללמוד אותו בגלל שהדגימה עבה יותר מדגימות מוצקים רגילות, וקשה להתאים את ההגדרות כדי למצוא את המיקוד המיטבי של הערוץ. לפני כל מדידה, השתמש בקרן חמצן של 1 keV כדי לסרוק את חלון הסיליקון ניטריד למשך כ-15 שניות להסרת זיהומי פני השטח. כמו כן, השתמש בתותח אלקטרונים (electron flood gun) כדי לפצות על טעינה פנית במהלך כל המדידות.
בשלב הבא, בחרו את המצב החיובי או השלילי לפני תחילת רכישת הנתונים. השתמשו ב-25 kiloelectronvolt bismuth three plus כקרן היונים הראשונית בכל המדידות. עבור פרופיל עומק, סרקו את קרן היונים הראשונית על שטח עגול שקוטרו כ-2 micrometers ברזולוציה של 32 pixels על 32 pixels.
כדי לצמצם את הזמן הנדרש לפריצה דרך ממברנת הסיליקון ניטריד, השתמש בקרן יונים ראשונית בעלת רוחב פולס ארוך. לאחר הפריצה דרך ממברנת הסיליקון ניטריד, שמור על אותו זרם למשך כ-200 שניות כדי להשיג נתונים מספיקים לשחזורי תמונות דו-ממדיים. לצורך איסוף נתונים, הקטן את רוחב הפולס ל-80 nanoseconds כדי לרכוש ספקטרומים בעל רזולוציית מסה טובה יותר.
המשיכו ברכישה זו למשך כ-200 שניות נוספות. באמצעות הממשק המיקרופלואידי של SALVI, קרן היונים הראשונית יכולה להפגיז ישירות את שכבת הפיברונקטין ההידרטציה. מספר צבירי מים ומקטעי חומצות אמינו מצוינים בנתוני ספקטרומטריית המסה של ToF-SIMS.
דבר זה מספק ראיה ישירה לתכונות של מולקולות המים המקיפות את מולקולות החלבון המהודרות ונמצאות בתוכן. כאן ניתן לראות את סדרת הזמנים של פרופיל העומק של סרט פיברונקטין מהודר ושל מים דה-יוניים. העוצמות של יונים שניים נבחרים הן זניחות לפני פריצת ממбраנת הסיליקון ניטריד.
ברגע שקרום סיליקון ניטריד ננקב, עוצמתם של היונים המשניים עולה באופן משמעותי. תהליך רוחב פולס קצר משמש להשגת נתונים עם רזולוציית מסה טובה יותר עבור שחזורי תמונה וספקטרום. תמונות ה-2-D של סרט הפיברונקטין המהוהוה ומים דאיוניים מייצגות את ספירות היונים המשניים הנבחרים מהדגימה.
ככל שהתמונה בהירה יותר, כך גבוה יותר מספר היונים המשניים. תמונות אינטואיטיביות אלו מספקות השוואה ברורה של יונים משניים נבחרים בין דגימות שונות, דבר המסייע בניתוח הנתונים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי המיקרו-ריאקטור חייב להיות אטום לחלוטין לפני התקנתו בתא הוואקום.
טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומי הביולוגיה וממשקים ביולוגים לחקור ספיחה של חלבונים, היצמדות של ביופילם, שכבות מונו-מולקולריות המורכבות על פני שטח ותופעות רבות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי הדרך לבחינת דגימות נוזליות שונות באמצעות SALVI ו-ToF-SIMS לנוזלים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
עבודה זו מציגה פרוטוקול לאפיון של שכבות חלבון ספחב בממסים מימיים באמצעות ספקטרומטריית מסות של יוניים משניים בזמן מעוף (time-of-flight secondary ion mass spectrometry). שיטה זו מאפשרת ניתוח in situ של ביו-מולקולות בממשק מוצק-נוזל, ומספקת תובנות לגבי מערכות ביולוגיות שונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביוכימיה
- ספקטרומטריית מסות
- ניתוח ביו-מולקולרי
רקע
- אפיון של ביומולקולות הוא חיוני להבנת האינטראקציות שלהן.
- ספקטרומטריית מסות של יוניים משניים בזמן מעוף (Time-of-flight secondary ion mass spectrometry) מאפשרת מיפוי מולקולרי מפורט.
- ניתן להחיל את השיטה על מערכות שונות, כולל תאי סרטן ואינטראקציות של תרופות.
- ניתוח in situ משפר את ההבנה של ביומולקולות בסביבתן הטבעית.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לטיפול בנוזלים ולהחדרת דגימות.
- ניתוח של ביו-מולקולות חלבון בתמיסות מימיות.
- אספקת תובנות לגבי התנהגותן של ביו-מולקולות בממשקים ביולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במערכת לניתוח בממשק ואקום-נוזל.
- ספקטרומטרית מסות של יונים משניים בשיטת זמן מעוף (Time-of-flight secondary ion mass spectrometry) לניתוח.
- הכנת דגימות הכוללת תמיסת אתנול 70%.
- אפיון in situ של חלבונים ספיחים.
תוצאות עיקריות
- החדרה מוצלחת של דגימות לתוך מיקרו-תעלות לצורך אנליזה.
- אפיון של חלבונים שנסמכו על פני שטח מוצק.
- תובנות לגבי אינטראקציות של ביומולקולות בסביבות נוזליות.
- יישומים פוטנציאליים במחקר הסרטן ובמחקרי אינטראקציית תרופות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח יעיל של ביו-מולקולות חלבון.
- ניתוח in situ מספק תובנות בעלות ערך לגבי התנהגות ביו-מולקולרית.
- ניתן להתאים שיטה זו למגוון יישומים של מחקר ביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולרי ישיר של חלבונים מהידרטסביים בסביבתם המימית הטבעית, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בניתוח ממשקים ביולוגיים. באמצעות שימור מצב ההידרטציה של החלבון במהלך ניתוח ToF-SIMS, היא מספקת תובנות מכניסטיות לגבי ספיחה ביו-מולקולרית ואינטראקציות בין מים לחלבונים הרלוונטיות לתיקוף מטרות. גישה זו תומכת במאמצי גילוי מוקדמים על ידי אספקת נתונים כימיים ברזולוציה מרחבית, המנחים הערכה פונקציונלית של המטרה ומפחיתים את אי-הוודאות בזיהוי מובילים (leads).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנוני ספיחה של חלבונים בממשקים מוצק-נוזל תחת תנאי הידרציה רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מספק זיהוי ישיר של פרגמנטים של חומצות אמינו וחתימות של אשכולות מים כדי לאשש את נוכחות החלבון ואת הקונפורמציה שלו.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביעד על ידי חשיפת האופן שבו שכבות הידרציה משפיעות על אינטראקציות של ביו-מולקולות עם פני השטח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר מפות מולקולריות ללא סימון (label-free) של התפלגות חלבונים ברזולוציה מרחבית של ~400 nm לצורך אפיון פני השטח של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מספק ספירות כמותיות של יוני משניים, המאפשרות הערכת שחזוריות בין תנאים שונים של קיבוע חלבונים.
- מוכנות לבדיקה: מקל על הכנת פני שטח המוכנים לסריקה על ידי אימות שלם שכבת החלבון לפני קמפיינים של סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין בדיקות קישור in vitro לסביבות דומות למצב טבעי על ידי אפיון חלבונים במצב מומה.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהיר האם אירועי קישור שנצפו מתרחשים באמצעות מגע חלבוני ישיר או שהם מתווכים על ידי שכבות הידרציה.
- רלוונטיות פרה-קלינית: תומך במידול מערכות הרלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לניתוח של פיברונקטין וחלבונים אחרים של המטריקס החוץ-תאי בתמיסה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הטכניקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקת מעורבות המטרה ועד לאופטימיזציה של מוביל, על ידי אספקת נתונים מולקולריים ממשקיים המשלים בדיקות של תמיסות במסה. היא ממוקמת לאחר תיקוף ראשוני של המטרה אך לפני סריקה תאית, ומספקת רובד מכניסטי למעבר משלב הפגיעה לשלב המוביל (hit-to-lead).
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של מנגנוני ספיחה ותפקוד של מטרות הקשורות למסלולים באמצעות מיפוי מולקולרי ישיר.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות על ידי אימות אחידות שכבת החלבון ועקביות האות התלויה במימד ההידרטציה.
- אנליזה: מספקת ספקטרומים ברזולוציית מסה ומפות יונים דו-ממדיות המאפשרות השוואה של פרגמנטים של חלבונים ומקבצי מים תחת תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לעבודה פרה-קלינית על ידי שמירה על מצב ההידרטציה של החלבון, ובכך משפרת את הרלוונטיות לתנאי ממשק ביולוגי in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לאנליזה של ממשקים, ישימה על פני מטרות ומשפחות חלבונים מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות במנגנוני אינטראקציה בין חלבון לפני השטח.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של ניתוח חלבונים מהודרים באמצעות טיפול בנוזלים הניתן לשחזור וממשק מיקרופלואידי תואם ואקום.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות go/no-go בשלב מוקדם, המבוססות על נתונים מכניסטיים של ממשקים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי הבהרה האם המעורבות של המטרה היא ישירה או מתווכת על ידי הידרציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח פני שטח בוואקום וטיפול במכשירים מיקרופלואידיים כדי לשמור על תפעול SALVI ללא דליפות.
- תלוי במכשור ToF-SIMS בעל יכולת החלפה בין מצבי יונים חיוביים/שליליים וביצוע פרופילי עומק.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי מדע הפני שטח וביולוגיה לצורך הכנת דגימות ופירוש נתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת השימוש מעבר לפיברונקטין לחלבונים אחרים בעלי קינטיקה של ספיחה משתנה.
- מוגבל על ידי הצורך בתאימות לוואקום גבוה במיוחד (ultra-high vacuum), המגביל את הניתוח למשטחים התואמים איטום מיקרופלואידי תחת ואקום.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Cleaning and Sterilization of the SALVI Microchannel
2:05
Immobilization of the Protein Film in SALVI
2:50
Install SALVI into the ToF-SIMS Loadlock Chamber
4:05
ToF-SIMS Data Acquisition
7:35
Results: Dynamic Liquid Surface and Liquid-solid Interface Analysis
9:02
Conclusion
