פענוח מסלולים axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים התחתית צ'יק עצבית ניצול ב אובו Electroporation
2 במאי 2010
וידאו זה מדגים כיצד לדמיין מסלולי axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים בחוט השדרה ניצול חומוס עובריים ב אובו Electroporation של גנים כתב תחת שליטתה של אלמנטים ספציפיים משפר.
שלום, אני חם מהמעבדה של ד"ר Review Klar במחלקה לנוירוביולוגיה רפואית באוניברסיטה העברית בירושלים. שלום, אני סופי אסמן ואני גם מהמעבדה של Lars. היום נראה לכם פרוצדורה ל-Innovo, אלקטרופורציה והכנת ספר פתוח של חוט השדרה.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור מסלולים אקסוניים של אוכלוסיות נוירונים המוגדרות גנטית בחוט השדרה העוברי. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו ביצי תרנגולת לבנות (White Leghorn) מופרות מטמפרטורת החדר לאינקובטור עם לחות, רצוי עם מגשי נדנוד, בטמפרטורה של 37 עד 38 מעלות צלזיוס.
חשוב לנטר את הטמפרטורה והלחות של האינקובטור כדי להשיגו עובריים חיים ומסונכרנים. את עוברי האפרוח מבצעים להם אלקטרופורציה כאשר הם מגיעים לשלבי hamburger and Hamilton או HH stage 18 to 20, שלב אופטימלי לביטוי ספציפי תלוי-מעכב (enhancer dependence specific expression). בשלב זה, הראש נמצא בזווית ישרה לגבי הגו.
בשלבים 18 עד 20 של HH, ניתן לראות גם מערכת נרחבת של כלי דם חו-עובריים, כגון כלי דם של קווי החיים (vital line vessels) הקדמיים והאחוריים, מימין ומשמאל. העוברים של האפרוח מגיעים לשלבים 19 עד 20 של HH לאחר 66 שעות של דגירה, ובזמן זה יש להוציא את הביצים מהמדגרה. לאחר הוצאת הביצים, הניחו אותן במצב אופקי והמתינו חמש עד 10 דקות. העובר נמצא כעת בקוטב העליון של הביצה.
לפני הפוריגציה החשמלית, הכינו את תמיסת Hank עם 100 units per milliliter של penicillin ו-0.1 milligrams per milliliter של streptomycin. הכינו תערובת רצויה של DNA בריכוז של two to five micrograms per microliter והוסיפו מספר גרגירים של צבע fast green לצורך ויזואליזציה קלה של ה-DNA המוזרק. הכינו בנוסף פפט פה (mouth pipette), מחט של מזרק סטרילי, מספריים קטנים וסרט דבק.
הכינו נימים מיקרוסקופיים על ידי מתיחת נימי זכוכית בקוטר 0.5 מילימטר באמצעות מושך פיפטות. מקמו את אלקטרודות הטונגסטן בתוך המיקרו-מניפולטורים וחברו את האלקטרודות למחולל הפולסים. הגדירו במחולל הפולסים מתח של מינוס 30 volts, אורך של 50 milliseconds לכל פולס ומספר פולסים של שלושה.
יש להמשיך לאלקטרופורציה לפני חשיפת העוברים והטיפול בהם. הכניסו מזרק לקוטב הצר של הביצה והוציאו חמישה עד שישה מיליליטרים של אלבומין מכל ביצה. האלבומין מוסר כדי למנוע את נשפכותו.
בעת החיתוך בשלב הבא, השתמש במספריים קטנים לצורך הגזירה. פתח חלון אובלי בחלקו העליון של הביצה לאחר חשיפת העובר, והלחה אותו עם 0.5 עד 1 milliliters של תמיסת hanks ו-penicillin streptomycin. לאחר מכן, השתמש בפיפטה ידנית כדי למלא את המיקרו-קפילרה מזכוכית.
בעזרת תערובת צבעי DNA, יש להטעין בקלות נימה מיקרו-קפילרית בעלת הקוטר המתאים ב-DNA. תחת מיקרוסקופ בינוקולרי, מקמו את העובר לצורך הזרקת ה-DNA לתוך צינור העצבים. הניחו את העובר כך שזנבו פונה אליכם.
בשלב התפתחותי זה, חוט השדרה נראה בבירור ולכן אין צורך בטכניקות ניגודיות. חוט השדרה אטום הן בקצה הראש והן בקצה הזנב. עם זאת, בעת ביצוע דקיקות עם מיקרו-קפילריה, יש להכין חורים בצינור העצבי ולחדור אליו בזווית רדודה; מיקרו-קפילריה דקה מספיק ובקוטר הנכון אמורה לחדור את הצינור מבלי לגרום לו נזק.
הזריקו את ה-DNA באמצעות פיפטה ידנית (mouth pipette). מיקרו-קפילרה בקוטר המתאים צריכה לשחרר את ה-DNA באמצעות נשיפה סדירה. הצבע הירוק צריך להתפשט מקצה הזנב ועד לבועיות של המוח המתפתח.
הזרק עד שהצינור העצבי מלא ב-DNA; נדרשת אלקטרופורציה של ה-DNA המוזרק כדי שיחדור לתאים. ראשית, מקם את האלקטרודות במקביל לצינור העצבי ובמרחק קרוב ככל האפשר ממנו, מבלי לגעת בצינור עצמו. ודא שהאלקטרודות מכוסות בנוזל כדי לאפשר מוליכות חשמלית במהלך הפולס.
בדרך כלל, תמיסת Hank שנוספה מיד לאחר חשיפת העובר מספיקה. אך אם לא, יש להוסיף טיפה אחת של תמיסת Hank רגע לפני הפולס, כאשר האלקטרודות ממוצבות וטבולות בנוזל, ולהפעיל את הפולס החשמלי; לאחר מכן, יש להוציא בזהירות את האלקטרודות ולאטום את החלון ואת הביצה באמצעות סרט דבק. חשוב לאטום את הביצה לחלוטין כדי למנוע התייבשות של העובר במהלך תקופת הדגירה העוקבת.
החזירו את הביצה לדגירה והדגירו אותה עד שהעובר של האפרוח מגיע לשלב התפתחותי של היום השישי (E6). כאשר העובר שעבר אלקטרופורציה מגיע ליום השישי (E6) להתפתחותית, שלושה ימים לאחר האלקטרופורציה, זהו הזמן לדימות; הוציאו אותו מהביצה בעזרת מספריים עדינים והניחו אותו בתוך צלחת פטרי מצופה סיליקון המכילה PBS.
הסיר את הקרומים ומתוך אתו העובר על צדו הגחוני באמצעות סיכות הננעצות בסיליקון כדי לקבע אותו במקומו. בעזרת מיקרו-קפילרית חדה מתנגסטן, בצע חתךlongitudal לאורך לוח הגג (roof plate) מהמוח האחורי ועד הזנב.
בצעו שתי חתכים לאורכיים נוספים משני צדי חבל השדרה, ובכך הפרדו את ganglion של השורש האחורי (DRGs) מחבל השדרה. הפרדו את ה-floor plate מהרקמה, החל מהזנב ועד למוח האחורי, תוך השארת חבל השדרה שלם. לבסוף, השתמשו במספריים עדינות כדי לחתוך את חבל השדרה בחתך רוחבי באזור המוח האחורי ולהפריד את חבל השדרה מהגוף.
כעת, לאחר שחוט השדרה בודד, פרסו אותו בתוך צלחת פטרי חדשה מצופה סיליקון המכילה PBS, תוך שימוש בסיכות כדי לקבע אותו מהמוח האחורי ועד הזנב, כדי ליצור דגימה שטוחה (flat mount). קבעו את חוט השדרה ב-4% paraformaldehyde ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר, ובצעו צביעה אימונוהיסטוכימית בהתאם לפרוטוקול הכתוב המפורט המצורף לקיבוע חוט השדרה במצב פתוח. הכינו את הדגימה להדמיה.
מרחו גריז או סיליקון בצורת מלבן על זכוכית כיסוי וטפטפו PBS בתוך המלבן. השתמשו בפינצטה כדי להניח את חוט השדרה, כאשר הוא מתוח במרכז המלבן, ושאבו את הנוזל שסביבו. בעזרת פיפטה, טפטפו אחת עד שתיים טיפות של חומר קיבוע (mounting media) על חוט השדרה וכסו בזכוכית כיסוי.
הפעל לחץ על לוכית הכיסוי. כדי למנוע בועות אוויר. שמור את השקופיות בחושך בטמפרטורה של 4 °C.
יש לבחון את חבל השדרה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. להלן מספר תוצאות מייצגות של נשירה אקסונית של נוירונים אינטר-ספינליים של גוזאלי רפתה בניסויי בקרה שבהם RFP מובע בכל הנוירונים באמצעות אלמנט מגביר אוניברסלי מ-CMV; רוב הנוירונים ואקסוניהם מסומנים. במצב זה, לא ניתן לפענח את מסלול האקסונים של תתי-אוכלוסיות נוירונליות.
עם זאת, כאשר מיישמים אלמנטים משפרים ספציפיים, נחשף מסלול אקסוני מוגדר של תת-אוכלוסייה ספציפית של נוירונים DI שניים בדוגמה זו. כך שהראינו לכם הרגע כיצד לבצע אלקטרופורציה של צינור עצבי של עוף עם משפר נוירונלי ספציפי ב-E3, וכיצד להכין חוט שדרה בשיטת "ספר פתוח" ב-E6. בעת ביצוע הליך זה, עליכם לזכור להיות זהירים וסבלניים.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם. בהצלחה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים פרוצדורה להדמיית מסלולים אקסונליים של נוירונים המוגדרים גנטית בחוט השדרה של עובר אפרוח באמצעות אלקטרופורציה in ovo. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחון מסלולים אקסונליים ביעילות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- הבנת מסלולים אקסוניים היא קריטית למחקר במדעי העצבים.
- אלקטרופורציה in ovo היא טכניקה המשמשת להחדרת גנים מדווחים.
- חוט השדרה של עוברי אפרוש משמש כמודל ללימוד התפתחות נוירונלית.
- אוכלוסיות נוירונליות המוגדרות גנטית יכולות לספק תובנות לגבי מעגלים עצביים ספציפיים.
מטרת המחקר
- להדמיית מסלולים אקסוניים בחוט השדרה העוברי.
- לשימוש באלקטרופורציה in ovo למחקרי ביטוי גנים.
- לשיפור ההבנה של התפתחות נוירונלית וקישוריות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העבר ביצי תרנגולת מופיות לדגירה בלחה.
- שמור על טמפרטורת דגירה של 37 עד 38 degrees Celsius.
- בצע אלקטרופורציה in ovo להחדרת גנים מדווחים (reporter genes).
- הכן תכשירים של חוט השדרה במבנה "ספר פתוח" (open book) לצורך ויזואליזציה.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מסלולים אקסוניים בחוט השדרה.
- הדגמה של יעילותו של תהליך electroporation in ovo.
- תובנות לגבי מסלוליהם של אוכלוסיות נוירונליות המוגדרות גנטית.
- ביסוס של שיטה מהימנה לחקר התפתחות נוירונלית.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי בעל ערך למחקר במדעי העצבים.
- אלקטרופורציה in ovo יעילה להחדרת גנים במודלים עובריים.
- הבנת מסלולי האקסונים יכולה לתרום למחקרים על היווצרות מעגלים עצביים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה מדויקת של מסלולי אקסונים באוכלוסיות נוירונליות המוגדרות גנטית, ובכך נותנת מענה לאתגר מרכזי בתיקוף מטרות שבו סימון דו-צדדי מטשטש את ההבחנה בין היטלים איפסילטרליים לקונטרלטרליים. באמצעות הגבלת ביטוי הרפורטר לצד אחד של צינור העצבים באמצעות אלקטרופורציה חד-צדדית in ovo, חוקרים משיגים הפחתת סיכונים מכניסטית של היפותזות לגבי מעגלים נוירונליים בשלב מוקדם של הגילוי. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בבחירת המטרה על ידי הבהרת תבניות קישוריות ספציפיות למסלול הרלוונטיות למודלים של מחלות התפתחותיות נוירולוגיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטי
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד של שלוחות אקסוניות של תתי-אוכלוסיות נוירונליות ספציפיות, המוגדרות על ידי רפורטרים המונעים על ידי אנהנסרים (enhancers).
- ערך תפעולי: מספק סימון חד-צדדי להבחנה בין אקסונים המקרינים לצד האיפסי-לטרלי (ipsilateral) לצד הקונטרה-לטרלי (contralateral), ובכך מפחית עמימות במיפוי המעגלים.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים של מטרות על ידי הבהרה האם אוכלוסייה נוירונלית מפעילה מסלולים מעוררים או מעכבים הקריטיים למנגנון המחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של מסלולי אקסונים כקריאה פנוטיפית לסריקת מודולטורים גנטיים או פרמקולוגיים של הנחיה עצבית.
- ערך תפעולי: מייצר תכשירי whole-mount סטנדרטיים וניתנים לשחזור, התואמים לדימות קונפוקאלי ברזולוציה גבוהה ולצינורות ניתוח אוטומטיים.
- ערך סקילביליות: עושה שימוש במודל של עובר אפרו, המאפשר הרחבה לבדיקה של מספר תנאים של פעילות מחזקת (enhancer) או יעילות אלקטרופורציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: ממפה מסלולים אקסונליים הרלוונטיים למחלה במודלים של חוט השדרה בחולייתנים, מה שמאפשר התאמה לסמנים ביולוגיים של הפרעות נוירו-התפתחותיות בבני אדם.
- המשכיות מכניסטית: מגשרת בין שלב התיקוף של מטרות בשלב הגילוי לבין הערכה פרה-קלינית של השפעות תרופתיות ברמת המעגל על צמיחה או הנחיה אקסונלית.
- קידום מותאם סיכון: מספקת מידע לקבלת החלטות של go/no-go על ידי חשיפה השאלה האם מטרה מסוימת מווסתת תבניות היטל ספציפיות הקשורות להחלמה תפקודית או פתולוגיה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מיצירת היפותזת מטרה ועד לזיהוי מוביל (lead), ומספקת תובנות מנגנוניות המקדימות את פיתוח הבדיקה התפקודית ותומכות בהתאמת ביומרקריים תרגומיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי ביטוי גנים ספציפי למגבירים (enhancers) לצורך הגדרת תתי-אוכלוסיות נוירונליות ומסלולי האקסונים שלהן.
- סריקה: מאפשר יצירת מערכות ביולוגיות מוכנות לבדיקה עם ביטוי רפורטר חד-צדדי וסטנדרטי להערכת השפעת תרכובות על הנחיית אקסונים.
- אנליטיקה: מספק קריאות מרחביות כמותיות של דפוסי היטלי אקסונים, מה שמקל על השוואה בין תנאים גנטיים או תנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי ביסוס מודלים של מסלולי אקסונים הרלוונטיים למחלה לצורך קורלציה של ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לבדיקה איטרטיבית של מבנים גנטיים, אלמנטים של מגבירים או פרמטרים של אלקטרופורציה במגוון מטרות נוירונליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי פתרון כיווניות ההקרנה האקסונית, גורם קריטי בהערכת השפעות תרופתיות ספציפיות למעגל.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה באמצעות פרמטרי אלקטרופורציה מוגדרים (מתח, אורך פולס, מספר) וטיפול מדורג בעובריו.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות שבהן נתיבים אקסוניים אינם תואמים למנגנונים טיפוליים רצויים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי זיהוי מטרות המודולות דפוסי הקרנה ספציפיים הרלוונטיים לנקודות קצה קליניות באינדיקציות של התפתחות נוירולוגית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות אמבריולוגיות, כולל שלבי התפתחות של עוברים, מיקרו-הזרקה ואופטימיזציה של פרמטרי אלקטרופורציה.
- תלוי בציוד כגון מחוללי פולסים, מיקרו-מניפולטורים, אלקטרודות טונגסטן ומיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך הדמיה.
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוז ה-DNA, בחירת אלמנטים מגבירים (enhancers) ומיקום האלקטרודות בין משתמשים ומעבדות שונות להשגת תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת המודל למערכות חולייתים אחרות או לסוגי נוירונים שאינם נוירונים אינטרנוינליים של חוט השדרה.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות של חיוניות העוברים לתנאי הדגירה ואתגר טכני בהשגת אלקטרופורציה חד-צדדית אחידה ללא פגיעה בצינור.
