ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)

המטרה הכוללת של גישה זו, המשלבת מנתח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה, ופלטפורמה מבוססת סינון תוכן גבוה, היא לספק מידע על מינונים יעילים, רעילות והשפעות ביולוגיות, כדי להשיג את פרופיל הרעלים של התרכובות שנבדקו. גישה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הטוקסיקולוגיה. התייחסות, למשל, לציטוטוקסיות, גנוטוקסיות ותגובות לחץ תאי.

יתר על כן, לא רק לספק מידע על מספר פרמטרים ביוכימיים ומורפולוגיים בו זמנית, ניתן ליישם אותו גם על מגוון שונה של סוגי תאים, ומודלים של תרביות תאים. בשל סמכות שיפוט ומגבלה, הגישה כולה תבוצע תוך הערכת פיסת תרכובת קצרה בלבד. מאותה סיבה, רק פרוטוקול אחד יוצג להדגמת הערכת סינון התוכן הגבוה.

ידגימו את ההליך סטפנו אקאלי ואלכסנדר לורן, טכנאים מהמעבדה שלי. כדי לראות את תאי האפיתל הרגילים של הסימפונות האנושיים, או תאי NHBE, תכנת את המכשיר כדי להגדיר את מספר ומשך מדידות העכבה. במחקר זה, הנתונים נרשמים כל 15 דקות, למשך 48 שעות.

מדוד את רקע הצלחת על ידי פיפטינג של 50 מיקרוליטר של מדיום מחומם מראש לכל באר של צלחת RTCA של 96 בארות. שלב זה מייצג דרישה טכנית למכשיר לחישוב ההתנגדות החשמלית הבינונית שתשמש כהתייחסות בסיסית לחישובים מבוססי תאים. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים בריכוז של 144,000 תאים למיליליטר למדיום שכבר נמצא בכל באר של צלחת ה- RTCA.

לאחר שהתא התחמם, חשוב מאוד להשאיר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד ולקבל פיזור תאים הומוגני. דגרו את לוחות ה-RTCA בעריסה בחממה, והתחילו לרשום את הנתונים עבור 24 השעות הבאות, פלוס מינוס שעתיים, לפני המינון. לבקרה החיובית, יש לדלל את תמיסת מלאי הסטאורוספורין של 10 מילי-מולאר, אחד עד 10, ב-DMSO.

הוסף חמישה מיקרוליטר מהדילול ל -195 מיקרוליטר בינוני כדי לקבל פתרון עבודה פי 5. עבור המרכיבים המזיקים והעלולים להזיק, ממיסים כל אחד מהם ברכב כדי ליצור תמיסת מלאי טוחנת אחת. לאחר מכן, יש לדלל כל תמיסת מלאי של חומר בדיקה, אחד עד 10, במדיום כדי ליצור תמיסה של 100 מילי-מולאר.

צור את לוחית האב המורכבת על ידי הוספת רכב בינוני פלוס 10% בבארות מ-B עד F, ואת התמיסה של 100 מילי-מולר בבאר A.בצע דילול סדרתי של חמישה שלבים, אחד עד 10, כדי להשיג את פתרונות העבודה פי 5. למינון, השהה את מכשיר ה-RTCA, פתח את העריסה כדי להסיר את לוחית החשיפה, והנח את הצלחת בכלי הטמפרטורה RTCA כדי למנוע קירור התאים, מה שעלול להשפיע על מדידת העכבה. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסה פי 5 מלוח המאסטר של התרכובת לתאים בשלוש עותקים, תוך שמירה על אותו סדר מינון כמו בלוחית המאסטר של התרכובת.

אל תסיר את מדיום תרבית התאים הקיים. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת בקרה חיובית פי 5 לתאים במחצית הימנית של השורה התחתונה, מבלי להסיר את מדיום התרבית הקיים. באופן דומה, הוסף 25 מיקרוליטר של מדיום לתאים במחצית השמאלית של השורה התחתונה.

לאחר איטום הצלחת עם אוטם הצלחות, הנח את הצלחת בחזרה בעריסת RTCA ונעל אותה. הפעל מחדש את הקלטת הנתונים לזמן החשיפה הרצוי. לאחר הקלטת הנתונים, נתח את נתוני הכדאיות של תאי RTCA כדי לקבוע באיזה חומר בדיקה להשתמש בניתוח HCS.

בניסוי זה, 1-אמינונאפטלן, ארסן, כרום וקרוטונלדהיד נבחרים לניתוח HCS. כדי לראות את תאי ה-NHBE, הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים ב-120,000 תאים למיליליטר לכל באר של לוח שחור של 96 בארות. לאחר השארת צלחת ה-HCS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, כדי לאפשר לתאים להיצמד לבארות, דגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24, פלוס או מינוס שעתיים, לפני המינון.

עבור הבקרה החיובית, חלק 40 מיקרוליטר מתמיסת המלאי של כל בקרה חיובית בעמודה שתיים. לאחר מכן, חלקו 20 מיקרוליטר מהרכב בעמודות שלוש וחמש. ו-40 מיקרוליטר של הרכב בטור ארבע.

משוך 12 מיקרוליטר מהבארות בעמודה שתיים, חלק אותם לבארות בעמודה שלוש וערבב. המשך עד לקבלת דילול סדרתי סופי עם שלוש מנות ורכב לכל תרכובת בקרה חיובית. כדי ליצור את לוחית הבקרה החיובית, הכינו דילול של 1 עד 40 במדיה של שלושת המנות והרכב.

כדי להכין את צלחת האב של התרכובת, יש להשעות מחדש ולדלל כל תמיסת מלאי של חומר בדיקה, 1 עד 10 אינץ' בינוני לריכוז של 100 מילימולר. בצע דילולים באמצעות מדיום עם 10% רכב כדי להשיג את המינונים ה-5x שנבחרו עבור כל חומר בדיקה. גם בקרות חיוביות וגם צלחת מורכבת מוכנות כעת למינון על לוחית החשיפה.

לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסות פי 5 מלוח המאסטר של התרכובת לתאים בשלוש עותקים, תוך שמירה על אותו סדר מינון כמו בצלחת המאסטר של התרכובת. אל תסיר את מדיום תרבית התאים הקיים. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת 5x מלוחית הבקרה החיובית לתאים בשורה התחתונה, תוך שמירה על אותו סדר מינון כמו בלוחית הבקרה החיובית.

הכן נפח מספיק של תמיסת הצביעה של תאים חיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, יש לדלל גם את צבע המיטוכונדריה וגם את צבע חדירות הממברנה בתמיסת הצביעה של התאים החיים, בהתאם להוראות הספק. הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת צביעת התאים החיים לכל באר של הצלחת המיועדת לבדיקת ציטוטוקסיות.

אין להסיר את מדיום תרבית התאים, ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. שאפו בעדינות את המדיום ואת תמיסת הצביעה והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לכל באר. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.

לאחר הדגירה, שאפו בעדינות את תמיסת הקיבוע ושטפו פעם אחת עם 100 מיקרוליטר לכל באר של מאגר כביסה. הסר את מאגר הכביסה, והוסף 100 מיקרוליטר לבאר של מאגר חדירות פי 1 לכל באר, לפני הדגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך. שאפו את מאגר החדירה, ושטפו את הצלחת פעמיים עם 100 מיקרוליטר לכל באר של מאגר כביסה.

לאחר מכן, שאפו את מאגר הכביסה והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר חסימה 1x לכל באר. לאחר מכן, דגרו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך. יש לדלל את הנוגדן נגד ציטוכרום C, אחד עד 250, בתמיסת נוגדנים ראשונית.

לאחר מכן, שאפו את המאגר החוסם והוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר, לפני הדגירה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך. לדלל את הנוגדן נגד עכברים, אחד עד 500, בנוגדנים משניים ובתמיסה גרעינית. כמו כן, יש לדלל את הצבע הגרעיני, אחד עד 1,000, בנוגדנים משניים ובתמיסה גרעינית.

לאחר שאיבת תמיסת הנוגדנים הראשונית, שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה לבאר באמצעות מכונת הכביסה. שאפו את מאגר הכביסה, והוסיפו 50 מיקרוליטר לכל באר של נוגדן משני ותמיסה גרעינית לכל באר של הצלחת. כעת, דגרו את הצלחת למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.

לאחר שאיפת הנוגדן המשני והתמיסה הגרעינית, שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל באר באמצעות מכונת הכביסה. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר לכל באר של מאגר כביסה. הצלחת מוכנה כעת להערכה במכשיר HCS והרכישה מתחילה.

מוצגות תוצאות מייצגות של כדאיות תאי RTCA של טיפול בחומרי בדיקה. השפעה תלוית מינון רעילה מתקבלת במהלך 24 שעות של חשיפה רק עם 1-אמינונפטלן, ארסן, כרום וקרוטונלדהיד, מכיוון שכולם הציגו LD50 מחושב של פחות מ-20 מילימולר. לא הושגה השפעה רעילה עם התרכובות האחרות.

מוצגות כאן, תוצאות HCS מייצגות רק עבור טיפול ב-1-אמינונפטלן. ההשפעה הרעילה של 1-אמינונאפטלן גורמת לנזק חמור לקרום התא, מה שמוביל לחדירות מוגברת של קרום התא באופן תלוי מינון, לאחר ארבע שעות של חשיפה. התרכובת משפיעה גם על המיטוכונדריה, וגורמת לעלייה במסה לאחר ארבע שעות של חשיפה, יחד עם שחרור ציטוכרום C, הניתן לזיהוי בגרעינים לאחר ארבע ו-24 שעות של חשיפה.

לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים-שלושה, מכיוון שרובם דורשים כשעה ביום של זמן מעשי להגדרה ומינון. בהתאם לפרוטוקול שנבחר, הקרנת התוכן הגבוה דורשת מקסימום שלוש וחצי שעות לביצוע הליך הצביעה כולו. בעת ניסיון הליך זה, זכור שלמרות שבחירה של מגוון רחב יותר של נקודות קצה מוסיפה מורכבות לזרימת העבודה, היא לא תגדיל את הזמן באופן משמעותי.

עם זרימת עבודה אופטימלית, למעשה, ניתן להעריך מספר צלחות במקביל. המשך הפיתוח של פלטפורמת סינון התוכן הגבוה, כולל הגדרת תאים אוטומטית לחלוטין, דילול תרכובת, מינון וצביעה, והוספת נקודות קצה חדשות, ירחיב עוד יותר את היכולת של פלטפורמת סינון התוכן הגבוה ככלי רב עוצמה לפרופיל טוקסיקולוגי. יתר על כן, השילוב של נקודות קצה טוקסיקולוגיות מרובות ובודדות בתפוקה כה גבוהה יביא אותנו צעד אחד קדימה במאמץ שלנו להפחית ניסויים כימיים בבעלי חיים.