ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד
23 ביוני 2016
אנו מציגים גישה להמחשת מולקולות DNA גדולות מוכתמות בפפטיד קושר DNA של חלבון פלואורסצנטי (FP-DBP) הקשורות על הפוליאתילן גליקול (PEG) ומשטח הזכוכית המצופה אבידין ונמתחות בזרימות גזירה מיקרופלואידיות.
המטרה הכוללת של הליך זה, היא ליצור מערכת ניתוח DNA נוחה למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, לתפעל DNA של מולקולה בודדת על משטחי זכוכית ששונו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדמיית DNA. כאשר בוחנים את ה-DNA העצמי, כמו גם חלבונים קושרים DNA ומולקולות קטנות אחרות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להתבונן ולנתח DNA נע בקלות. כדי להתחיל, הנח כיסויי זכוכית על מתלה PTFE ואבטח אותם במקומם, באמצעות חתיכת סרט איטום חוט PTFE. לאחר עטיפת הכיסויים, השאירו חתיכה באורך חמישה סנטימטרים מהסרט שתשמש לטיפול במתלה במהלך הליך הניקוי.
במכסה אדים, שלבו 350 מילילטר של חומצה גופרתית ו -150 מיליליטר מי חמצן בכוס זכוכית של ליטר אחד ליצירת תמיסת תחריט פיראנה. לאחר מכן, הנח את מתלה הכיסויים לתוך התמיסה. לאחר שעתיים, רוקנו את הכוס ושטפו היטב את הכיסויים במים נטולי יונים.
המשך לשטוף את הכיסויים עד שה-PH של המים בכוס מגיע ל-PH ניטרלי. לאחר מכן, סוניקציה של מדפי הכיסויים בכוס המחברת מים למשך 30 דקות, כדי לנקות ולגזור את מצעי הזכוכית. מים ריקים מהכוס, רגע לפני אמינוסילניזציה. כדי להתחיל, הכינו את תמיסת האמינוסילניזציה, על ידי הוספת שני מיליליטר אלקוקסילן, וחומצה אצטית קרחונית של 10 מיליליטר ל -200 מיליליטר אלכוהול מתיל במיכל פוליפרופילן נקי.
לאחר מכן הנחת הכיסויים הנקיים לתוך התמיסה. לאחר מכן, הניחו את הכיסויים הנקיים בתמיסה המוכנה ונערו אותם בטמפרטורת החדר וב -100 סל"ד למשך 30 דקות. לאחר מכן, סוניקציה של המיכל עם הכיסויים הנגזרים למשך 15 דקות ב 75 וואט.
לאחר מכן, יש לנער אותם שוב בטמפרטורת החדר וב-100 סל"ד למשך 30 דקות לפחות. לאחר שתסיים, רוקן את התמיסה מהכוס ושטוף את הכיסויים שלוש פעמים, בזהירות. פעם אחת עם אלכוהול מתיל ופעמיים עם אלכוהול אתילי.
לאחר השטיפה האחרונה, אחסן את הכיסויים באלכוהול אתילי והשתמש בהם תוך שבועיים. ראשית, הכינו 10 מיליליטר מתמיסת נתרן ביקרבונט טוחנת 0.1 וסננו אותה דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון. לאחר מכן, ממיסים שני מיליגרם של ביוטין PEG succinimidyl carbonate ו-80 מיליגרם של PEG succinimidyl valerate לתוך 350 מיקרו ליטר של תמיסת הנתרן ביקרבונט המסוננת.
הגן על התמיסה מפני אור באמצעות צינור הגנה מפני אור. מערבל את הצינור במרץ, למשך 10 שניות ולאחר מכן, צנטריפוגה אותו ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת כדי להסיר בועות. לאחר מכן, יש לשטוף שקופית זכוכית עם אצטון ואחריה אלכוהול אתילי.
לאחר השטיפה, הניחו לשקופית להתייבש לחלוטין באוויר. הניחו טיפה של 50 מיקרוליטר מתמיסת ה-PEG על מגלשת הזכוכית הנקייה. הורד לאט כיסוי סילני אמינו על הטיפה בזווית קלה, כדי לא ליצור בועות אוויר מתחת לכיסוי.
לאחר מכן, הנח את המגלשות בתא ישר, חשוך ולח למשך שלוש שעות לפחות עד לילה, בטמפרטורת החדר. בסיום, אטמו את תמיסת ה-PEG הנותרת בצינור ההגנה מפני האור, ושמרו אותה על ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שטפו היטב את כיסויי PEGylated במים נטולי יונים ולאחר מכן אחסן אותם במקום חשוך ויבש עד לשימוש.
על מנת ליצור את תא הזרימה, הניחו רצועות סרט דו צדדיות ודביקות על מחזיק אקרילי, כך שהוא מיושר בניצב לחורי כניסה ויציאה ולא יפריע לאף אחד מחורי התעלה. לאחר מכן, שפשפו את הקלטת, בעזרת קצה פיפט, כדי לאטום את התעלות. לאחר מכן, הנח כיסוי PEGylated, כשהצד PEGylated פונה כלפי מטה, על החלק העליון של הסרט כדי ליצור תאי זרימה.
כדי למנוע דליפה של תמיסה כלשהי, לחץ על החלק העליון של הכיסוי מעל האזור שבו מונח סרט דו צדדי. לאחר מכן, הוסף דבק אפוקסי יבש מהיר לשולי התאים, כדי לאבטח אותו במקומו. לאחר מכן, חבר חתיכת צינור באורך 2.5 ס"מ למזרק אטום לגז ואטום את המפרק בדבק אפוקסי.
לאחר מכן, חבר צינור ארוך וגמיש לצינור המגיע מהמזרק. ושוב, אטמו את המפרק בדבק אפוקסי. מלאו את הצינור המקושר למזרק במים נטולי יונים, וודאו שאין בועות אוויר.
לאחר מכן, הכנס את הצינור לחור של תא הזרימה האטום בדבק אפוקסי. והניחו קצה פיפט של 200 מיקרוליטר על החור השני, שישמש כמאגר. הגדר את קצב הזרימה של משאבת מזרק ל -50 מיקרוליטר לדקה.
לאחר מכן, הזרימו 20 מיקרוליטר של תמיסת חלבון avidin לתא ושמרו אותה שם למשך 10 דקות. לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר של נוקלאוטידים של אוליגו דאוקסי ביוטיניל, למזרק. הזרימו אותו לתא, ושמרו אותו שם למשך 10 דקות.
אם נעשה שימוש בטרנספראז טרמינל, דלג על העמסת נוקלאוטידים של אוליגו דאוקסי. לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר של תמיסת DNA למזרק, הזרים אותו לתא בקצב של 10 מיקרוליטר לדקה ושמור אותו שם למשך 30 דקות. לאחר הדגירה של 30 דקות, שטפו את תא הזרימה עם 40 מיקרוליטר של מאגר TE 1X ב-50 מיקרוליטר לדקה.
לאחר הכביסה, טען את החדר ב-40 מיקרוליטר של אותו FP-DBP בריכוז של 80 ננו-מולר, ב-1X TE.To לראות את טווח המתיחה המלא של מולקולות ה-DNA, להחיל קצבי זרימה שונים בהתאם לאורכי ה-DNA המשמשים. התבונן ב-DNA תחת עדשת אובייקטיבית של פי 60, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הנה סרטון מיקרוסקופ פלואורסצנטי המציג מולקולות DNA של בקטריופאג' למבדה, קשורות לפני השטח, נמתחות על ידי זרימה לאחר קשירה עם נוקלאוטידים משלימים של אוליגו ביוטיניל.
תחת זרימה, מולקולות ה-DNA המוארכות במלואן, נמדדות באורך של 16.5 מיקרון. לעומת זאת, הבקטריופאג' T4 DNA momlecules, מוארך לאורך של 56.4 מיקרון, תחת זרימה. התארכות זו הפיכה, וניתן להאריך ולהרגיע את ה- DNA מספר פעמים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להשתמש ב- FP-DBP בניתוח DNA גדול יותר כמו גם להדגים מתיחה והרפיה של פולימר DNA.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להדמיה של מולקולות DNA גדולות הצבועות באמצעות פפטיד קושר-DNA עם חלבון פלואורסצנטי (FP-DBP). הטכניקה כוללת קיבוע של מולקולות אלו על פני שטח זכוכית מצופה פוליאתילן גליקול (PEG) ואווידין, ומתיחתן באמצעות זרימות גזירה מיקרופלואידיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ויזואליזציה של DNA
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- מניפולציה של מולקולה בודדת
רקע
- המחקר מתמקד בניתוח של DNA וחלבונים נקשרי DNA.
- מטרתו היא לשפר את הנוחות של מערכות לניתוח DNA.
- שיטה זו מאפשרת תצפית על DNA בתנועה.
- היא מיועדת לשימוש עם מיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת למניפולציה של מולקולת DNA בודדת.
- שיפור הוויזואליזציה של ה-DNA ושל חלבונים נלווים.
- הקלה על ניתוח הדינמיקה של ה-DNA.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת לבישי זכוכית על גבי מעמד PTFE.
- קיבוע הלבישיים באמצעות סרט איטום PTFE.
- הליך ניקוי למשטחי הזכוכית המעובדים.
- שימוש בזרימות גזירה מיקרופלואידיות למתיחת DNA.
תוצאות עיקריות
- עיגון מוצלח של מולקולות DNA גדולות על משטחים שעברו שינוי.
- ויזואליזציה יעילה של דינמיקת DNA באמצעות צביעת FP-DBP.
- יכולת משופרת לניתוח DNA בתנועה בזמן אמת.
- הדגמה של פוטנציאל השיטה במחקר DNA.
מסקנות
- הטכניקה מציעה גישה חדשנית לוויזואליזציה של DNA.
- היא מספקת תובנות לגבי אינטראקציות של DNA עם חלבוני קישור.
- שיטה זו עשויה לקדם את המחקר בתחום הביולוגיה המולקולרית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
ויזואליזציה ישירה של מולקולות DNA גדולות הקשורות לפני השטח באמצעות פפטידים קושרי DNA המצומדים לחלבון פלואורסצנטי (FP-DBP) מאפשרת חקירה מדויקת של אינטראקציות DNA-חלבון ברמה של מולקולה בודדת. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשרשראות הגילוי בביופארמה. השיטה משפרת את הביטחון החזוי עבור פיתוח בדיקות וזרימות עבודה של סריקה בשלבים הבאים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על אירועי קישור של DNA-חלבון לצורך הבהרה מכניסטית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות קישור ל-DNA בסביבה מבוקרת.
- מקל על בחינה מונחית-היפותזה של אינטראקציות מולקולריות הרלוונטיות למסלולי מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פלטפורמה הניתנת לשחזור להכנת תשמיות DNA מתוקפות עבור מבחנים בעלי תוכן גבוה.
- מאפשר מדידה כמותית של מתיחה והרפיה של DNA תחת תנאים מוגדרים.
- תומך בסטנדרטיזציה וביכולת הרחבה לסריקת תרכובות המכוונות לאינטראקציות בין DNA לחלבונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מחקרים מכניסטיים רלוונטיים למחלות על ידי מידול דינמיקה של DNA-חלבון ברמת המולקולה הבודדת.
- מציע רצף מהשלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני עבור שיטות טיפול המכוונות ל-DNA.
- מפחית עמימות ביולוגית בהערכת סיכונים בשלבים מוקדמים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים ועד לפיתוח בדיקות ומחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת בזיהוי מובילים ובתיקוף מטרות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות והבהרה של מסלולים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של אינטראקציות DNA-חלבון.
- סריקה: מספקת substrates של DNA קשורים לפני השטח, המוכנים לבדיקה, עם תוצאות כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת מדידה בזמן אמת של התארכות והרפיה של DNA לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תובנות מנגוניות לתיקוף של מודלים פרה-קליניים כאשר אינטראקציות DNA-חלבון רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מחקרים מגוונים של חלבונים נקשרי DNA לאורך תוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליך תיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה לוויזואליזציה של DNA לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרת סיכון ביולוגי בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים המכוונים ל-DNA.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של משטחים, מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב גישה למיקרוסקופים אפי-פלואורסצנטיים ולמערכות בקרת זרימה מיקרופלואידיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת משטחים וסימון DNA.
- ייתכן הצורך בהתאמות עבור אורכי DNA שונים או מחלקות שונות של חלבוני קישור.
- פסיבציה של המשטח והפחתת קישור לא ספציפי הן קריטיות לקבלת תוצאות מהימנות.
