משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

שבבי DNA הם פלטפורמת מחקר אטרקטיבית לביולוגיה סינתטית עצמית, שפותחה במקור על ידי קבוצת BASF, המאפשרת תפעול מעגלי גנים במבחנה לאורך פרקי זמן ממושכים. עם פרוטוקול זה, אנו מקווים להפוך את הטכנולוגיה הזו לזמינה למגוון רחב יותר של חוקרים. השיטה שלנו, הנדונה ליתוגרפיה של בפור, מייצגת אסטרטגיה לשתק את הדנ"א בהתבסס על תגובת עקירת גדילי הדנ"א.

עוצמתה של טכניקה זו טמונית ביכולות הליתוגרפיות הרב-שלבית שלה, בשחזור הפשוט שלה ובזמינות המסחרית של כל הרכיבים. בדומה לפתרונות ביו-שבב אחרים, ניתן לשלב את bephore עם טכנולוגיות שונות. לדוגמה, מברשות גנים פונקציונליות ניתן להרכיב בתוך מיקרו תאים לביטוי חלבון.

כדי להתחיל, להכין תערובת RCA על ידי ערבוב מים חמישה חלקים עם חלק אחד של תותב אמוניה 30% ב זכוכית. מחממים את התערובת ל-70 מעלות צלזיוס על צלחת חמה תוך כדי ערבוב. ברגע שהוא מגיע 70 מעלות צלזיוס, להוסיף חלק אחד 30% מי חמצן.

לאחר מכן מניחים רקיק סיליקון בקוטר 100 מ"מ לתוך הפתרון, כדי להסיר ממנו חומר אורגני וחלקיקים. לאחר 30 דקות, מוציאים את המצע, שוטפים אותו ביסודיות במים מבקבוק כביסה, ומייבשים אותו באקדח חנקן. מיד להמשיך עם PEGylation של המצע.

כדי להשיג זאת, תחילה לדלל ביוטין-PEG-Silane בטולואן יבש ל 5 מיליגרם למיליליטר, ומערבולת הפתרון עד שהוא מעורבב היטב. עם המצע ממוקם צלחת פטרי זכוכית, לאט pipette הפתרון על המצע, מכסה את כל פני השטח, אבל להימנע לאפשר את הפתרון לזרום מעבר לקצה. לאחר המשטח מכוסה, לסגור את צלחת פטרי, ולאחר מכן להוסיף כיסוי נוסף.

לאחר 30 דקות, להסיר את הכיסוי, ולהוסיף כ 40 מיליליטר של אלכוהול isopropyl לצלחת פטרי. ואז להוציא את המצע, לשטוף אותו שוב ביסודיות עם אלכוהול isopropyl, ולייבש אותו עם אקדח חנקן. כאשר יבש, לאחסן את המצע בחושך עד שהוא נחוץ.

הכן מצע באמצעות חותך זכוכית או אזמל כדי ליצור סנטימטר אחד על ידי חתיכות סנטימטר אחד. לאחר מכן, הוסף סימון יישור פשוט על-ידי יצירת שריטה קצרה מהמרכז לכיוון קצה המצע. לפוצץ את כל החלקיקים הקטנים את השבב באמצעות אקדח חנקן.

לאחר מכן, מערבבים שתי טיפות של דבק סיליקון דו-רכיבי, ומחילים את הדבק על פני השטח של השבב, ומשאירים את האזור סביב קצה השריטה ריק. שם הדבק מספק מחסום הידרופובי, שמירה על פתרונות מים על השבב. זה מקל על צעדי הכביסה הבאים, ומפחית את כמות ה-DNA הנדרשת עבור דגירה.

בשלב מאוחר יותר, הדבק ניתן לקלף בקלות. בשלבים הבאים, DNA photocleavable מטופל רק בסביבת אור צהוב. מכסים את השבב בכ-10 מיקרוליטרים של תערובת בפור בטמפרטורת החדר, ומציבים את השבב בקופסה מלאה חלקית במים כדי להפחית את האידוי.

לאחר שעה אחת, לשטוף את השבב מספר פעמים עם PBS כדי להסיר כל תערובת bephore מאוגד. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של תערובת פסיבציה לשבב. לאחר שעתיים, לשטוף את השבב מספר פעמים עם PBS כדי להסיר את סוכני פסיבציה מאוגדת.

חותכים מסכת צילום מודפסת לגודל המתאים כדי להתאים למחזיק מסכה מתאים. הוסף אותו במיקום עצירת השדה ולהשתמש ב סימוני היישור כדי ליישר את המסיכה במחזיק. כאשר המצע ממוקם על שלב המיקרוסקופיה, הכנס מסנן אדום לנתיב התאורה והתמקד על משטח המצע.

לאחר מכן, נווט אל אזור המצע אשר ייחשף. לאחר מכן, הכנס את מחזיק המסיכה, חסום את התאורה ושנה למסנן UV. בעוצמת אור נמוכה, פתח את התריס ולהשתמש במצלמה כדי למקד במהירות את המסכה על המצע.

כאשר המצע מיושר כעת והמסכה ממוקדת, חסום את נתיב האור למצלמה והאיר את המצע בעוצמת אור גבוהה לזמן החשיפה הרצוי. לאחר החשיפה, הסר את הדגימה מהמיקרוסקופ, והסר בזהירות מאגר רב ככל האפשר מהמצע מבלי לייבש אותו. לאחר מכן, להוסיף 10 עד 20 microliters של DNA עם הרצף עבור חיבור על פני השטח.

מניחים את המצע בקופסה רטובה כדי למנוע ממנו להתייבש, ודגירה את ה-DNA על המצע במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. על מנת להתבונן בביטוי הגן המודר במיקרוסקופ הפוך, הכינו תחילה בנפרד את שני החלקים של מחזיק הדגימה. התחל על ידי הדבקת שבב bephore עם מברשת גנים משותקת על מחזיק השבב, באמצעות סרט דבק דו צדדי.

לאחר מכן, הוסיפו קצת שומן ואקום סביב החור המרכזי של החלק התחתון של המחזיק, והכניסו את מחזיק השבב. עכשיו להרכיב את החלק העליון של המחזיק. חותכים שבב PDMS דק עם תאים קטנים ככל האפשר, משאיר ערוץ פתוח לצד אחד מאוחר יותר לאפשר חילופי פסולת ומולקולות מבשר על ידי דיפוזיה הבא, פלזמה לטפל להחליק כיסוי זכוכית בצד האחורי של שבב PDMS עם פלזמת חמצן.

מיד לאחר הטיפול, מניחים את שבב PDMS במרכז מגלשת הזכוכית, כאשר התאים מצביעים כלפי מעלה. לאחר מכן, אופים את ה עם PDMS במשך שעה אחת ב 70 מעלות צלזיוס. זמן קצר לפני הרכבת מחזיק הדגימה כולו, פלזמה לטפל במגלשת הזכוכית עם שבב PDMS כמו קודם.

לאחר מכן, הוסיפו קצת שומן ואקום סביב החור הגדול של המחזיק העליון, והצבו עליו את מגלשת הזכוכית עם ה-PDMS. לוחצים בעדינות את הזכוכית על השומן. בזהירות להסיר את המאגר מהשבב, ולשטוף אותו פעם אחת עם 10 microliters של מערכת ביטוי עצמי.

לאחר מכן, הוסיפו 60 מיקרוליטרים של מערכת ביטוי עצמי לשבב, והסירו את דבק הסיליקון הדו-רכיבי מהקצוות. עכשיו, להוסיף 20 microliters של מערכת הביטוי על PDMS. לאחר הנחת טיפה על PDMS, לבדוק במהירות את המיקרוסקופ סטריאוסקופי כי התאים רטובים היטב וללא בועות אוויר.

אם יש בועות אוויר, לנסות לשטוף אותם משם. כדי להרכיב את שתי החלקים של המחזיק, וליישר תאים ומברשות DNA, לעבוד תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. שתק את המחזיק התחתון בזרוע אחיזה כך ששני הברגים וגני הכנפיים יהיו נגישים בקלות בשתי הידיים.

הכנס את המחזיק העליון למחזיק התחתון והורד אותו עד ששחררות מערכת הביטוי ללא תאים יתמזגו. לאחר מכן, ודאו שהתאים וסימן היישור נמצאים באזור דומה במישור XY. מלמטה, לדפוק את כנף עד שהם נוגעים בצד התחתון של המחזיק.

תוך יישור התאים ואת השבב במישור XY, הדק בעדינות את כנפי הכנף. שלב זה דורש ניסיון מסוים, ותלוי בבניית בעל הדגימה. יש ללחוץ על ה-PDMS על השבב רק בכוח עדין.

לאחר מכן, לרסס ספוג במארז נגד אידוי עם מים, ולהכניס את המחזיק לתוך התיבה. לאחר מכן, מלא מזרק חמישה מיליליטר עם דבק סיליקון שני רכיבים, ולהשתמש בו כדי לאטום את התיבה. לבסוף, מעבירים את התיבה למיקרוסקופ מבוקר טמפרטורה, ומדמים את מברשת הדנ"א ואת התגובה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תהליך ליתוגרפי בן שני שלבים, המבוצע כאן על מגלשת זכוכית בפור, מניב דפוסים חופפים של גדילי דנ"א המסומנים באופן פלואורסצנטי. בהדגמה זו של ביטוי גנים על שבב, DNA משותק בתא בצד השמאל. כאשר נחשפים לתערובת הביטוי, חלבון הפלואורסצנט הצהוב YPet מסונתז מהדנ"א משותק.

כדי להעריך את הפעילות של מערכת ביטוי הגנים, התאוששות הפלואורסצנטיות נצפית לאחר שלב הלבנה. במשך שעתיים, עוצמת הפלואורסצנטיות התאוששה במהירות. עם זאת, לאחר ארבע ושש שעות, זה לא התאושש, המציין כי ללא אספקה טרייה של תערובת הביטוי, התגובה הסתיימה סביב שעה ארבע.

למרות ביטוי גנים מוגבל במערכת סגורה, זה יכול להתקיים על פני פרקי זמן ארוכים יותר על ידי אספקת תאי הביטוי עם מולקולות מבשר נוספות באמצעות מיקרו נוזלים. שיטת bephore משמשת לשתק אוליגונוקלאוטידים או DNA באורך גנים, אשר ניתן ליישם כדי לבנות מערכות של מברשות DNA אינטראקציה לביטוי גנים מחדש עצמית. הטכניקה עשויה לשמש גם עבור יישומים אחרים בביופיזיקה, כגון מחקרי פלואורסצנטיות מולקולה אחת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לפברק ביוצ'ים bephore מן ופלים או שקופיות זכוכית, ולשלב אותם בפרויקטים המחקר שלך.