תת-סוגים של Jejuni קמפילובקטר SSP. doylei המבודד באמצעות ספקטרומטריית מסה מבוססת PhyloProteomics (MSPP)

המטרה הכוללת של הליך ספקטרומטרי מסה זה, הנקרא MSPP או PhyloProteomics מבוססת ספקטרומטריית מסה, היא תת-סוג חיידקים ברמת הזן. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחומי המיקרוביולוגיה, האפידמיולוגיה וההיגיינה. לדוגמה, ניתן להשתמש בו כדי לנתח מצבי התפרצות על ידי הדמיה של קשר פילופרוטומי.

בהשוואה לשיטות הקלדה אחרות, MSPP זול לכל מדגם, ומהיר מאוד. זיהומים נוסוקומיאליים הם נושא בעל חשיבות הולכת וגוברת, ואנו מקווים שניתן יהיה להרחיב את תוכנית ה-MSPP שלנו לכיוון אפידמיולוגי של חיידקים אחרים, או אפילו פטריות. תוכנית ה-MSPP שלנו מספקת תובנה לגבי הקשר של זנים, כך שלצורך חיזוי פנוטיפים רלוונטיים, כגון עמידות לתרופות, או אפילו אלימות, הגיוני ליישם אותה כאשר פנוטיפים אלה מתאמים עם גנוטיפים ספציפיים.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו שני צינורות של תמיסת מטריצה על ידי המסת 2.5 מיליגרם של HCCA ב-250 מיקרוליטר של תערובת ממס אורגנית, איזוניטריל של 50%. הוסף אינסולין אנושי רקומביננטי ככיול פנימי לאחד מהם, ואז 47.5% מים מזוקקים כפולים ו-2.5% חומצה טריפלואורואצטית. לאחר מכן, מורחים כמות בגודל ראש סיכה של מושבה מזן הייחוס, ישירות על לוחית מטרה של מאלדי.

לקביעת המסה המדויקת של שיא הכיול, הנח על מיקרוליטר של תקן הבדיקה במקום אחר. כסו כל נקודה של חיידקים וסטנדרטיים עם 1 מיקרוליטר של תמיסת מטריצה דוקרנית HCCA והשאירו אותם להתגבש בטמפרטורת החדר. עבור כל זן שיש לנתח, חזור על הכנת המריחה.

מכסים כל נקודה במיקרוליטר אחד של תמיסת מטריצת HCCA דוקרנית ומניחים להתגבש בטמפרטורת החדר. לחלופין, ניתן להפיק חלבונים מתאים קשים לשקר. לשם כך, קצרו כ -5 מושבות מתרבות צלחת אגר עם לולאת חיסון.

השעו אותם ב-300 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים בצינור תגובה של 1.5 מיליליטר, וערבבו אותם היטב על ידי פיפטינג חוזר ונשנה עד שמושבות החיידקים מושהות לחלוטין. לאחר מכן מוסיפים 900 מיקרוליטר אתנול מוחלט ומערבבים. צנטריפוגה את הדגימה ב-13,000 גרם למשך דקה אחת.

לאחר ייבוש הגלולה, השעו אותה מחדש על ידי צנרת למעלה ולמטה ב-50 מיקרוליטר של 70% חומצה פורמית. לאחר מכן, מוסיפים 50 מיקרוליטר אצטו-ניטריל ומערבבים. הסר את הפסולת על ידי צנטריפוגה ב-13,000 גרם למשך 2 דקות.

בסיום, העבירו 1 מיקרוליטר של שם העל למיקום דגימה על לוחית מטרה מאלדי. לאחר שאפשרו לדגימה להתייבש, כסו כל נקודה במיקרוליטר אחד של תמיסת מטריצת HCCA והשאירו להתגבש בטמפרטורת החדר. בשלב זה, בצע ניתוח MALDI-TOF על ידי איסוף 600 ספקטרום ב-100 צעדי זריקה עבור כל נקודה.

ראשית, לחץ על לשונית ההפעלה האוטומטית בתוכנת התצורה של ספקטרומטר המסה. פתח את השיטה על ידי לחיצה ימנית על כפתור השיטה ובחירת השיטה מהתפריט הנפתח. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על כפתור העריכה כדי לפתוח את עורך שיטות ההפעלה האוטומטית.

תחת הכרטיסייה צבירה, הגדר את ערך הזריקה המשביעת רצון ל-100 ואת ערך הסכום ל-600. עבור כל ספקטרום, בחר את שיא הקליברנט מהרשימה, לחץ על הקצאה אוטומטית'ולחץ על אישור'לאחר קבלת ספקטרום מסה מכל נקודה, קבע באופן ניסיוני את המסה המדויקת של שיא הכיול, על ידי פתיחת ספקטרום עם דפדפן הספקטרום ומציאת השיא במסה הצפויה בהשוואה לספקטרום ללא קליברנט. בדוק ששיא הקליברנט אינו מוסתר על ידי שום סמן ביולוגי אחר של האורגניזם המעניין.

מנתוני ריצוף הגנום של זן הייחוס, חשב את המשקל המולקולרי המונואיזוטופי התיאורטי של כל אחד מהחלבונים המקודדים על ידי תרגום רצף ה-DNA לרצף חומצות האמינו המתאים. העלה קובץ 'או העתק הדבק' רצף חלבון זה לתיבת הקלט של לוח המשאבים הביואינפורמטי המתאים, וחשב את הנקודה האיזואלקטרית התיאורטית והמשקל המולקולרי. העתק את התוצאות לגיליון אלקטרוני עם עמודה אחת המכילה את מזהה הגן ועמודה אחרת את המשקל המולקולרי.

מיין את השורות לפי משקל מולקולרי מחושב, כדי להקל על חיפוש מסות. הכנס עמודה נוספת לגיליון האלקטרוני עבור המשקל המולקולרי של הצורה המנותקת, תוך הפחתת 135 דאוטון מהמשקל המולקולרי המונו-איזוטופי. הקצה כל מסת סמן ביולוגי עיקרי שנמדד למסות המחושבות מזן הייחוס, על ידי חיפוש המסה הנמדדת מטבלת הגנום.

בגיליון אלקטרוני אחר, רשום את המסה והמזהה עבור כל יון סמן ביולוגי. כעת כייל את ספקטרום המסה המתקבל מבודדי האוסף כפי שנעשה עבור זן הייחוס. עבור מבודד אחד בכל שורה, זהה סמנים ביולוגיים משתנים בספקטרום המסה, רשום את המסה הנמדדת עבור כל סמן ביולוגי ואת האיזופורם החזוי בעמודות המתאימות.

ספקטרום המסה MALDI-TOF של תת-המין C-Jejuni doylei ATCC 49349 מכיל 14 יוני סמן ביולוגי טעונים יחידים שניתן לזהות על ידי השוואה של המסות המולקולריות המחושבות עם ספקטרום הייחוס. בתוך האוסף, זוהו צורות איזו שונות עבור L32 ללא מתיונין, L33 והחלבון ההיפותטי המקודד על ידי gil152939117, S20 M ו-S15 M.המסות הנותרות שהוקצו ליוני סמן ביולוגי היו קבועות בבודדים שנבדקו. החלפת חומצות האמינו המתאימה לשינוי המסה זוהתה על ידי הגברת PCR וריצוף סנגר של הגן המסוים באמצעות הפריימרים המפורטים כאן.

רצפי חומצות האמינו של כל יוני הסמנים הביולוגיים הכלולים בתוכנית MSPP, כמו גם האיזופורמים האלליים שזוהו מצוינים כאן. דנדרוגרמה UPGMA מבוססת MLST שנבנתה מתת-המין שנבדק C. jejuni doylei מבודד, מראה שכל מבודד שייך לסוג רצף MLST אחר. ולזן LMG7790 יש את המרחק הפילוגנטי הארוך ביותר.

כפי שניתן לראות עם MLST alaysis, לבודד LMG7790 יש את המרחק הפילופרודאומי הארוך ביותר בניתוח MSPP של תת-המין שנבדק C. jejuni doylei isolates. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום אחד אם היא מבוצעת כראוי. תוך כדי ביצוע הליך זה, חשוב לזכור את הרעילות של חומרים מסוימים ששימשו במהלך הניסוי.

לדוגמה, אצטו-ניטריל יכול לגרום לגירוי בעור. בנוסף, ל-MSPP ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף DNA, כדי לנתח פרמטרים נוספים, כמו נוכחות של גנים עמידים. פיתוח טכניקה זו סולל את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור פוטוגניה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד MSPP פועל וכיצד ניתן ליישם אותו על שאלות ספציפיות. אל תשכח, שעבודה עם פתוגנים אלימים יכולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ציוד מעבדה S2.