זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב

מטרת ניסוי זה היא לזהות חלבונים, אינטראקציות בין חלבונים ואת הרכב תתי-היחידות של קומפלקסי MultiPro טבעיים מ-e coli. דבר זה מושג על ידי הגברה של תוצרי PCR ליניאריים ספציפיים לרצף, המקודדים את תג ה-SPA וסמן ברירה, אשר משולבים ומבוטאים במסגרת כהיתוכי קצה קרבוקסילי ברקע של ddy 3, 3 0 תוך שימוש במערכת רקומבינציה של בקטריופאג lambda. כשלב שני, מבוצע טיהור דו-שלבי באמצעות חרוזי זיקה של cow modlin ו-Anti-Flag כדי להפיק ביעילות קומפלקסים חלבוניים בריכוז נמוך. לאחר מכן, החלבונים שנקשרו, אשר נשטפו באמצעות cow modlin, באפר שטיפה או CEB, מעוכלים עם trypsin ומעובדים באמצעות ספקטרומטריית מסות לזיהוי החלבונים.

התוצאות שהתקבלו מראות כי מספר תתי-היחידות של אנזים ה-RNA polymerase הליבתי, כולל הגורמים של סיום התעתוק ומניעת הסיום, טוהרו ביעילות יחד עם חלבון תת-היחידה D של ה-RNA polymerase המסומן, מה שמעיד על כך שניתן לחשוף ביעילות רכיבים שזוהו לאחרונה באמצעות גישה זו. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים להתקשות בביצוע טיהור זיקה (affinity purification) בשני סבבים, שבו עיבוד קפדני של ליזאטים של תאים עם תמיסות באפר מתאימות הוא הכרחי לחלוטין כדי להבטיח הצלחה בהתאוששות יעילה של קומפלקסים בשכיחות נמוכה וגבוהה מתרביות בקנה מידה גדול. את נהלי טיהור הזיקה והספקטרומטריה של מסות יבצעו Olga Kagan ו-HBO guo, שני טכנאים במעבדתי. פרוטוקול זה מתחיל במיקוד של רצפים מוגברים ספציפיים לשבט DDY three 30, שבו מבוטא מנגנון הרקומינציה של Lambda red כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

בשלב הבא, זרע את זן החיידקים המבטא את מערכת הרקומינציה של farge Lambda למשך לילה ב-2 milliliters של מצע Luria bati או LB בטמפרטורה של 32 degrees Celsius, בניעור של 180 RPM. למחרת, תחסן 1 milliliter מהתרבית של הלילה לתוך 70 milliliters של מצע LB טרי בבקבוק Erlenmeyer של 500 milliliter. גדל את התחסון בטמפרטורה של 32 degrees Celsius בניעור של 180 RPM עד שה-OD 600 מגיע לכ-0.8. השרה את התאים על ידי דגירה של הבקבוק במקלחת מים בטמפרטורה של 42 degrees Celsius תוך ניעור עדין ב-180 RPM למשך 15 דקות.

מיד לאחר האינדוקציה, דגרו את הבקבוק באמבט של תערובת קרח ומים למשך 30 דקות לפחות תוך כדי ניעור. לאחר קצירה ושטיפה של התאים כפי שמתואר בנוהל הכתוב, השביה מחדש את משקע התאים ב-700 µL של מים סטריליים קרים בקרח, כדי להפיק תאים אלקטרו-קומפטנטים באמצעות אלקטרופורציה. הכניסו 1 µL של האמפליקון המטוהר לתוך 40 µL של התאים האלקטרו-קומפטנטים.

התאים עוברים אלקטרופורציה לאחר רקומבינציה הומולוגית ואינטגרציה. התרמיפנסיים שביצעו בהצלחה רקומבינציה של תג ה-slash cassette לתוך הכרומוזום נבחרים על בסיס עמידות ל-canmycin. נבחרים מספר טרנספורמנטים לצורך western blotting כדי לאמת את היווצרותם התקינה של חלבוני היתוך המסומנים ב-SPA, באמצעות נוגדן Anti-Flag M2 הסלקטיבי לאפיטופים של דגל (flag) בתוך תג ה-SPA. העבר 10 milliliters של תרבית הלילה ל-990 milliliters של tb טרי, המועשר ב-25 micrograms per milliliter של canmycin, בתוך בקבוק של ארבעה ליטרים.

גדלו את התרבית בטמפרטורה של 32 degrees Celsius עם ניעור רציף ב-250 RPM למשך חמש עד שש שעות, עד שה-OD 600 מגיע לערך שבין שתיים לשלוש. העבירו את תרבית ה-e coli SPA tag בנפח של one liter לבקבוקי צנטריפוגה נקיים וסובבו את התאים בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius ובכוח של 3, 993 ×g למשך 15 דקות. לאחר מכן, השהו מחדש את התאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

העבירו את הדגימות לכוס נירוסטה סטרילית המונחת על קרח לצורך סוניקציה. טבלו את הפרוב בתוך הדגימה ובצעו סוניקציה למשך שלוש דקות. לאחר הסוניקציה, המתינו שתי דקות נוספות לקירור הדגימה כדי למנוע התחממות יתר, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגציה לליזאט שהתקבל מהסוניקציה.

העבר בזהירות את supernatant S מנבובת הצנטריפוגה לנבובת פלקון מפוליפרופילן בנפח 50 milliliter. הקפא את הדגימה באמצעות חנקן נוזלי ואחסן את תמצית התאים הקפואה שעברה סוניקציה לתקופה מקסימלית של שישה חודשים בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius לשימוש עתידי. כדי להתחיל בניקוי זיקה (affinity purification) עבור תמצית התאים הקפואה שעברה סוניקציה, הנח את הנבובת במים קרים והדגר את תמצית תאי ה-TH עם שלושה microliters של benzo, נוקלאז, למשך 30 דקות בטמפרטורה של four degrees Celsius.

לתערובת זו, הוסף את הדטרגנט הבלתי-יוני Triton X 100 ו-200 µL מת сусפנסיות של Anti-Flag M2 agarose beads. ערבב בעדינות את התוכן על ידי סיבוב של המבחנה במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר שלוש שעות של סיבוב, סבב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 1,700 ×g למשך שש דקות. לאחר הסבב, הסר בזהירות כמה שיותר מה上נפח (supernatant) מבלי להפריע למשקע הרפוי.

יש להשעות מחדש את המשקע ב-SNA שנותר ולאחר מכן להעבירו לעמודת הפרדה (prep column) מפוליפרופילן. יש להסיר את פקקי הפיתוח התחתונים של העמודה כדי לאפשר לאלוט להישפך בכוח הכבידה. לאחר מכן, יש לשטוף את העמודה חמש פעמים ב-200 µL של FC buffer בריכוז 1x ולהמשיך לשלב השחרור באמצעות TEV כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר השלב, סגרו את החלק העליון והתחתון של העמודה באופן הדוק. ערבבו בעדינות את התוכן בעמודה על ידי סיבוב למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסיבוב למשך לילה, רוקנו את האלואט על ידי הסרת המכסה העליון והפקק התחתון אל תוך עמודה חדשה.

שטפו את העמודה הישנה עם 400 µL של באפר קישור Cal Modlin בריכוז 1x ו-150 µL של תרחיף חרוזי קישור Cal Modlin. אלוטו את החלבון הקשור לארבעה פראקציות של 50 µL לתוך מבחנה EPRFresh, באמצעות באפר אלוציה Cal Modlin בריכוז 1x.

חלק את הפראקציה שנאלוטה לשתי מבחנות eend orph נקיות בנפחים שווים. לאחר מכן, ייבש את התוכן של שתי המבחנות באמצעות speed vacuum. האלואט המיובש ממבחנה אחת משמש להרצת ג'ל בצביעת כסף כפי שמתואר בטקסט, בעוד שהשני נשמר בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.

לשימוש עתידי בספקטרומטריית מסות, הוסף לדגימה המיובשת 50 µL של חוצץ העיכול ו-0.9 µL של tris phosphine hydrochloric acid בריכוז 100 mM; הדגר את התערובת למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר עבור שלב הרדוקציה. לאחר מכן, הוסף 1 µL של IDO acetamide בריכוז 500 mM והדגר בחושך למשך 40 דקות נוספות כדי לאפשר אלקיליזציה של הדגימה. לאחר סבב ההדגרה השני, הוסף לתערובת 1 µg של trypsin. הדגר את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש שעות או למשך לילה בטמפרטורת החדר לאחר ההדגרה.

יש לוודא כי התגובה נעצרת על ידי הוספת 1 µL של חומצה אצטית. לאחר מכן, הכינו את ה-Millipore zip tip, קצה פיפטה, כפי שמתואר בטקסט, כדי להבטיח קישור יעיל של הפפטיד לצינורית הקצה. ערבבו את תערובת הפפטידים 20 פעמים, ושטפו את שאריות תערובת הפפטידים שאינם קשורים לקצה הפיפטה באמצעות שאיבה וסילוק של תמיסת השטיפה.

חזור על הליך זה פעמיים כדי להבטיח קישור יעיל של תערובת הפפטידים לקצה הצנרת, כאשר קצה הצנרת מכיל את הפפטיד הקשור. שאב 10 µL של תמיסת ההרטבה והשיווי (equilibration solution) והעבר למבחנה מסוג Eppendorf נקייה. חזור על שלב זה פעמיים.

לאחר ייבוש הדגימות שנשטפו ב-speed vacuum, ניתן לנתח את הדגימות באופן מיידי באמצעות ספקטרומטריית מסות או לאחסן אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לפני השימוש. המיקרו-עמודות המשמשות בהליך זה ארוזות בכ-10 סנטימטרים של שרף lunar C 18 בגודל של 3 מיקרון, והן מחוברות למקור יוני pro Zion nano electrospray הממוקם בקו אחד עם מכשיר ה-orbitrap. משאבת pro Zion nano flow binary HPLC משמשת להגשת קצב זרימה יציב בקצה של כ-300 ננוליטר לדקה במהלך הפרדת הפפטידים; כדי להשיג דילול של הפפטידים, הגדירו מדרג של בופר אורגני בהתאם למורכבות הדגימה.

עבור דגימת SPA זו של e coli, הממס של הפאזה הניידת A מכיל 95% HPLC gradient water ו-5% aceto nitrile עם 0.1% formic acid, בעוד שממס B מכיל 5% HPLC gradient water ו-95% aceto nitrile עם 0.1% formic acid. לאחר ספקטרומטריית מסות, יש לחפש את הספקטרה באמצעות אלגוריתם חיפוש במאגרי מידע כגון seaquest מול מאגר נתונים של רצפי חלבונים של e coli. יש לסנן את התוצאות סטטיסטית באמצעות אלגוריתם הסתברותי כגון star quest כדי להבטיח שיעור נמוך של גילויים שגויים. הן RNA polymerase sigma factor המסומן ב-SPA והן חלבון yak LA בעל תפקוד לא ידוע עברו טיהור משותף ספציפי עם אנזים ה-core RNA polymerase, כולל תתי-היחידות alpha, beta ו-beta prime, וכן עם ה-RNA polymerase recycling factor. בניגוד ל-RNA polymerase sigma factor המסומן, yak L נקשר בנוסף ל-transcription termination anti determination factor חיוני, מה שמרמז על תפקוד ייעודי בתהליך השעתוק.

מספר חלבונים קטנים יותר שהתטההרו יחד זוהו גם הם באמצעות LCMS ולא היו נראים על הג'ל, כולל תת-היחידה Omega של ה-RNA polymerase וגורמי תמלול, סיום וקביעה, וכן USA ו-NUSD. לעומת זאת, בניסוי עצמאי, רכיבי ניידות הגופרית המסומנים, S-U-F-B-S-U-F-C ו-SUFD, התטהרו יחד, מה שמעיד על השתתפות משותפת בביוסינתזה של צבירי ברזל-גופרית כקומפלקס פיגום יחיד. דוגמה מייצגת זו מדגישה את העובדה שלקומפלקסי MultiPro חיידקיים שנחקרו היטב בעבר ובעלי אנוטציות רבות, המשתתפים בתהליכים ביולוגיים חיוניים, ישנם לעיתים קרובות רכיבים נלווים חדשים שניתן לזהותם ביעילות.

בגישה זו, מספר העותקים הנמוך של חלבון ה-SUFB עשוי היה להוביל לעוצמת אות חלשה ביחס לעוצמה החזקה שנצפתה בניסויי ה-pull down של SUFC ו-SUFD. כדי להגדיר את הרכבם של קומפלקסים חלבוניים רב-יחידות יציבים, הוקצו ציוני co purification לאינטראקציות ברמת ביטחון גבוהה, תוך התחשבות בייחודיות של קשרי bait prey, bait bait ו-prey prey. לאחר מכן, באמצעות נהלי קיבץ גרפיים כגון אלגוריתם ה-markoff clustering, זוהו מקבצי חלבונים נפרדים מרשת ה-PPI ההסתברותית המחולקת.

ניתן להדמיה רשתות אינטראקציה משוערות באמצעות cyto scape. שילוב של נתוני פרוטאומיקה עם ראיות נוספות לקשרים תפקודיים המוסקים משיטות גנומיקה יכול לשמש לחקירת תפקידים מכניסטיים חדשים של חלבוני e coli שסומנו בעבר. כאן, הוגדרו תת-רשתות של קומפלקסים של חלבונים ומודולים תפקודיים המשתתפים כשכנויות תפקודיות רחבות יותר ב-e coli.

אשכול ההיררכיה הראשי שגראהם מציג מדגים את דפוסי התחזיות הפונקציונליות ואת האנוטציות הקיימות עבור גנים מאופיינים וגנים "יתומים" מבחינה תפקודית של e coli; צבעים צהוב וכחול מייצגים פונקציות קיימות ופונקציות מושמטות בהתאמה, בעוד שעוצמת הגוון משקפת את מדדי הביטחון. תהליכים ביולוגיים הקשורים לשכבויות שונות מצוינים מצד ימין, וההוספות מראים את הרכיבים הבודדים של שכבה מייצגת בהתבסס על מדדי דמיון של רשת אינטראקציות פיזיקליות ופונקציונליות משולבת. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד קומפלקסים חלבוניים יציבים מ-e coli באמצעות גישת טיהור זיקה בשילוב עם ספקטרומטריית מסות.

בבסיסו, ניתן ליישם טכניקה זו כדי לאפיין קומפלקסים של חלבוני ממברנה או קומפלקסים של חלבונים מכל מין אחר, ככל שניתן לבצע עבורם רקומבינציה.