שיטה מהירה ופשוטה עבור בידוד גבוה באמצעות-לשים של מירנה מן ליפופרוטאין בצפיפות הגבוה מאוד מטוהר
27 ביולי 2016
מייקרו RNA לשחק תפקיד רגולטורים חשוב והם מתעוררים כמו מטרות טיפוליות חדשניות למחלות אנושיות שונות. הוכח כי miRNAs נישאים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה. פיתחנו שיטה פשוטה לבודד HDL מטוהרים במהירות מתאים לניתוח מירנה מפלסמה אנושית.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לפתח גישה פשוטה לבידוד מהיר של ליפופרוטאינים מטוהרים בצפיפות גבוהה מפלזמת הדם האנושית לצורך ניתוח מיקרו RNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהפטולוגיה וקרדיולוגיה, כגון הבנת המנגנונים המולקולריים ותפקודי ההגנה של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה. כמה יתרונות עיקריים של טכניקה זו הם שמיקרו RNA HDL מטוהר מגיע מבודד מראש מנפח קטן יותר של דגימות תוך פרק זמן קצר.
בפרוטוקול זה, פלזמה מתקבלת מדגימות דם ורידיות היקפיות בצום על ידי שלבי צנטריפוגה מרובים כמתואר בטקסט הפרוטוקול. העבירו את הפלזמה לצינור חדש. ולמדוד את צפיפות הפלזמה באמצעות מד צפיפות בטמפרטורת החדר, לפי הוראות היצרן.
כדי להסיר את האקסוזומים המסתובבים המייצגים מקור לזיהום מיקרו RNA, הוסף 252 מיקרוליטר של תמיסת משקעים אקסוזומים למיליליטר אחד של פלזמה. ולדגור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן צנטריפוגה את התערובת למשך 30 דקות כדי להוציא את האקסוזומים.
העבירו מיליליטר אחד של הסופרנטנט שנוצר לצינור אולטרה-צנטריפוגה עבה פוליקרבונט להמשך עיבוד, כפי שמודגם בקטע הווידיאו הבא. בידוד של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה, או HDL, מושג על ידי פרוטוקול אולטרה-צנטריפוגה בצפיפות שיפוע של שלושה שלבים, הכולל בידוד רציף של ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד, או VLDL, ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה, או LDL, ו-HDL. יש להכין את שלושת פתרונות הצפיפות השונים, A, B ו-C, טריים, בהתאם להליך המתואר בטקסט הפרוטוקול.
בצינור אולטרה-צנטריפוגה עבה פוליקרבונט בנפח 6.5 מיליליטר, מערבבים מיליליטר פלזמה ו-200 מיקרוליטר שומן אדום 7B נטול נוקלאז. לאחר מכן, שכבו בזהירות חמישה מיליליטר של תמיסה A על גבי התערובת. במידת הצורך, הוסיפו עוד Fat Red 7B על גבי תמיסה A כדי לאזן את המשקל של כל צינור.
טען את הצינורות לרוטור מקורר מראש. הכניסו את הרוטור לצנטריפוגה רצפתית וצנטריפוגה למשך שעתיים. בסוף הריצה, שתי שכבות צריכות להיות גלויות.
הסר 1.5 מיליליטר מהשכבה העליונה, המייצגת את שבר ה- VLDL. ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בפיפטה כדי להעביר ארבעה מיליליטר מתחתית הצינור לצינור חדש של 50 מיליליטר.
זה מכיל את שבר ה-LDL וה-HDL. השלב הבא הוא בידוד ה-LDL. מערבבים שני מיליליטר של תמיסה B ו-100 מיקרוליטר שומן אדום 7B נטול נוקלאז לתוך הצינור המכיל את מקטע ה-LDL וה-HDL.
שים קרח למשך חמש עד עשר דקות. העבירו 6.5 מיליליטר מהדגימה המעורבת לצינור אולטרה-צנטריפוגה עבה פוליקרבונט. טען את הצינור לרוטור וצנטריפוגה מקוררים מראש למשך שלוש שעות.
בסיום הצנטריפוגה, הסר 1.5 מיליליטר מהשכבה העליונה, המייצגת את שבר ה- LDL ושמור על ארבע מעלות צלזיוס. העבירו ארבעה מיליליטר מתחתית הצינור, המכילים את שבר ה- HDL לצינור סטרילי של 50 מיליליטר. השלב השלישי הוא בידוד HDL.
מערבבים שני מיליליטר של תמיסה C, 100 מיקרוליטר שומן אדום 7B נטול נוקלאז, ו-15 מיקרוליטר של 98% מרקפטואתנול בטא לתוך הצינור, המכיל את חלק ה-HDL. בדוק את צפיפות התערובת. טען את הצינור לרוטור וצנטריפוגה מקוררים מראש למשך שלוש שעות.
לאחר מכן, הסר שני מיליליטר מהשכבה העליונה, המייצגת את שבר ה- HDL, ושמור על ארבע מעלות צלזיוס. יש להסיר עודף מלח משברי הליפופרוטאין כדי למנוע הפרעה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ו-PCR לאחר מכן. בסרטון זה יודגמו התפלה וריכוז רק עבור חלק ה-HDL.
הוסף 13 מיליליטר PBS קר לשבר ה-HDL והעביר למכשיר מסנן צנטריפוגלי עם חיתוך המשקל המולקולרי של 10K. צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד, ב-4000 פעמים גרם, וארבע מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות. יש להמליח את שבר ה- HDL, בפעם השנייה, באמצעות 13 מיליליטר PBS קר, וצנטריפוגה כמו קודם.
לאחר הצנטריפוגה, הסר את הליפופרוטאין המכיל מומסים, ושמור על ארבע מעלות צלזיוס. כדי להעריך את האיכות והטוהר של הליפופרוטאינים המבודדים, בוצעה אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז עם תקני ליפופרוטאין אנושיים, הכלולים כהתייחסות לגודל. תוצאות מייצגות מבידוד, ללא בטא מרקפטואתנול, הראו כי מקטע ה-HDL נטול כל זיהום של VLDL ומציג ניידות אלפא טיפוסית.
עם זאת, חלק ה-HDL מראה גם עקבות של ניידות בטא עקב זיהום בליפופרוטאינים. תוספת של בטא מרקפטואתנול לתמיסה C, במהלך שלב הצנטריפוגה האחרון, מסירה למעשה את כל הליפופרוטאינים המזהמים מחלק ה- HDL. כדי להדגים את ההיתכנות של כימות מיקרו RNAs, הנישאים ב-HDL אנושי, מטוהרים בשיטה זו, שני מיקרו-RNA שונים הוגברו על ידי PCR כמותי בזמן אמת.
בעלילות הגברה אלה, הקווים האופקיים מייצגים את סף הזיהוי. נתוני PCR מייצגים בזמן אמת מ-HDL מבודד, שהתקבלו משש דגימות, הראו זיהוי עקבי של שני המיקרו-RNAs. לבסוף, ניתוחי עקומת ההיתוך מראים בבירור שיא יחיד מובהק עבור שני המיקרו-RNA, התואם את ההגברה הספציפית ב-PCR הקודם.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך תשע שעות, יחד עם הליכי ההתפלה, אם היא נעשית כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעבוד בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס, בכל עת. ולהתאים את הצפיפות של כל שבר ליפופרוטאין לפני אולטרה-צנטריפוגה.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו טוהר ה-HDL. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תאפשר לחוקרים, בתחום התסמונת המטבולית, לחקור מיקרו RNA הקשורים ל-HDL כסמנים ביולוגיים, בבני אדם עם חשד למחלת כבד שומני. זה עשוי לשמש גם כדי להבין טוב יותר את תפקודו של HDL ואת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם הוא משנה את הביולוגיה של התא.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מפושטת לבידוד מהיר של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDL) מטוהרים מפלזמה של דם אנושי, המקלה על ביצוע אנליזות של microRNA. הטכניקה שואפת להגביר את ההבנה של המנגנונים המולקולריים והתפקודים המגינים של HDL במצב של בריאות ומחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- קרדיולוגיה
רקע
- MicroRNAs הם רגולטורים חיוניים ומטרות טיפוליות פוטנציאליות.
- ידוע כי HDL נושא miRNAs בצפיפות גבוהה.
- הבנת תפקידו של HDL עשויה להשפיע על תחומי ההפטולוגיה והקרדיולוגיה.
- שיטות קיימות עלולות להיות גוזלות זמן ולדרוש נפחי דגימה גדולים יותר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לבידוד מהיר של HDL מפלזמה אנושית.
- הקלת ניתוח microRNA למטרות מחקר.
- שיפור היעילות בחקר תפקודי ההגנה של HDL.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות דם ורידי פריפריאלי ממצב של צום.
- שלבי צנטריפוגה מרובים להשגת פלזמה.
- מדידת צפיפות הפלזמה באמצעות דנסיטומטר.
- בידוד HDL המתאים לניתוח miRNA.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת בידוד מהיר של HDL מנפחי דגימות קטנים יותר.
- ניתן לנתח ביעילות microRNAs שבודדו מראש מ-HDL.
- פוטנציאל למתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי ההפטולוגיה והקרדיולוגיה.
- הבנה משופרת של המנגנונים המולקולריים של HDL.
מסקנות
- שיטה פשוטה זו משפרת את חקר ה-HDL וה-miRNAs.
- היא מציעה גישה יעילה מבחינת זמן עבור חוקרים.
- הטכניקה עשויה להוביל לתובנות חדשות לגבי מנגנוני מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
בידוד יעיל של miRNAs מ-HDL מטוהר מאוד מאפשר גילוי של סמנים ביולוגיים (biomarkers) בתפוקה גבוהה ומחקרים מכניסטיים במסלולי מחקר של מחלות מטבוליות ומחלות לב וכלי דם. פרוטוקול יעיל זה מפחית את נפח הדגימה ואת זמן העיבוד, ובכך תומך במחקר תרגומי בר-הרחבה ובתיקוף של סמנים ביולוגיים על פני תיקי מחקר שלמים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי באבחון מבוסס miRNA ובהערכה של מטרות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של miRNAs הקשורים ל-HDL כסמנים ביולוגיים תפקודיים במסלולים רלוונטיים למחלה.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבהרת המטען המולקולרי של HDL בתסמונות מטבוליות.
- מסייע באימות מטרות באמצעות אספקת דגימות miRNA מטוהרות לבדיקות תפקודיות המשך.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק פראקציות HDL בטוהר גבוה המתאימות לתהליכי עבודה סטנדרטיים של כימות miRNA.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה על ידי מזעור זיהום מאקסוזומים ומליפופרוטאינים אחרים.
- מאיץ את המוכנות לסריקה של פאנלים של סמני miRNA במסגרות של מחקר קליני.
מחקר תרגומי ופקליני
- מתאימה את בידוד ה-miRNA לאסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים עבור התוויות מטבוליות ומסמיות לב.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת פרופילים עקביים של miRNA מדגימות אנושיות.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות הפקת נתונים כמותיים ואמינים של miRNA.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבידוד מהיר ובספיקת רב של miRNA מ-HDL, ובכך היא תומכת הן בגילוי מוקדם של סמנים ביולוגיים והן בתיקוף (validation) בשלבים מאוחרים יותר.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): מספקת פלטפורמה לבחינת השערות לגבי איתות miRNA המתווך על ידי HDL ותקשורת בין איברים.
- סריקה (Screening): מספקת תוצרי miRNA כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה (Analytics): מספקת דגימות miRNA באיכות גבוהה לביצוע qPCR והערכת טוהר אלקטרופורטית, התומכות בניתוחים השוואתיים.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מקלה על התאמת פרופילים של סמני miRNA לפנוטיפים קליניים בקוהורטות של מחלות מטבוליות.
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): קובעת פרוטוקול סטנדרטי הניתן להתאמה למספר מודלים של מחלות וצוותי מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במחקרי סממנים ביולוגיים (biomarkers) ומטרות של miRNA.
- ערך תפעולי: מפחית את דרישות הדגימה ואת זמן העיבוד, ובכך מאפשר תפוקה גבוהה יותר.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות נחרצת של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) עבור תוכניות אבחון וטיפול מבוססות miRNA.
- השפעה על הפורטפוליו: משפר את תעדוף מטרות וסממנים ביולוגיים של miRNA על פני אינדיקציות שונות, תוך התחשבות בסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באולטרה-צנטריפוגציה וטיפול ב-RNA כדי להבטיח את הניקיון והתנובה.
- נדרשת גישה לצנטריפוגות במהירות גבוהה, לדנסיתומטרים ולתשתיות של ביולוגיה מולקולרית.
- דורש בקרה קפדנית של הטמפרטורה והתאמת צפיפות לצורך הדירות (reproducibility).
- סטנדרטיזציה בין צוותים חיונית לצורך השוואתיות בין מחקרים.
- ספיקת הדגימות עשויה להיות מוגבלת על ידי קיבולת הסרימרג'ה ומיומנות המפעיל.
