התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של תסיסנית בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע
20 באוגוסט 2016
אנו מתארים כאן הגדרה התנהגותית ושיטת ניתוח נתונים לבדיקת תגובות הריח של עד 100 זבובי חומץ (Drosophila melanogaster). ניתן להשתמש במערכת זו עם גירוי ריח יחיד או מרובה, וניתנת להתאמה להפעלה אופטוגנטית או להשתקה של תת-קבוצות עצביות.
המטרה הכוללת של מערך זה היא לבחון התנהגויות ריח של זבובים באולפקטומטר של ארבעה רבעים באמצעות סקריפט תוכנה אוטומטי למעקב אחר זבובים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לאופן שבו מערכות עצביות של חוש הריח מזהות את העולם החיצוני, וכיצד המוח מפענח ומכוון החלטות התנהגותיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא רב-תכליתית וחזקה, ומאפשרת בדיקה חוזרת של תגובות הריח על ידי אוכלוסיית זבובים בזירה ניסויית גדולה.
עבור פרוטוקול זה, הכינו חמישה תאי ריח המורכבים ממיכל חיצוני מפלסטיק, מיכל פנימי מזכוכית ותוספת מכסה PTFE בהתאמה אישית. התוספת היא מכסה מיכל מקורי עם החלק המרכזי הוסר, ושני שסתומים חד כיווניים מחוברים. השתמש בארבעה מתאי הריח לבקרת ממס, ובתא אחד לריח בדיקה.
ודא שכל תא נקי, ולאחר מכן טען מיכל ריח עם מיליליטר אחד של ממס או דילול ריח. לאחר מכן, בדוק את מיקום המיכל בתא הפלסטיק, וודא שלא נשפך נוזל. אבטח את המכסה באמצעות הבורג וטבעת O על תוספת ה-PTFE כדי למנוע נזילות.
מגדלים את הזבובים על מדיום קמח תירס רגיל. בבקבוק רגיל, הניחו 30 זכרים ו-30 נקבות, ואפשרו להטיל ביצים במשך חמישה ימים בטמפרטורת החדר. מבקבוקים כאלה, אספו זבובים שזה עתה נסגרו.
עבור כל קבוצת ניסוי, אספו 25 זכרים ו-25 נקבות זבובים תחת הרדמה קצרה של פחמן דו חמצני ותנו לקבוצה להזדקן על מדיום זבוב רגיל במשך יומיים עד ארבעה ימים. 40 עד 42 שעות לפני הניסוי, העבירו את העוקבה לבקבוקון עם כ-10 מיליליטר של ג'ל אגרוז אחוז אחד ללחות ללא מזון. רעב עוזר להגביר את התנועה כולה, ויותר מ-90% מהזבובים אמורים לשרוד את תהליך הרעב.
אם יותר מ-10% מתים, מה שיכול לקרות בגנוטיפ חלש, נסו להשתמש ברעב של יום אחד לכל הזבובים בניסוי. לפחות חמש דקות מראש, הפעל את בקר הטמפרטורה והגדר אותו ל -25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חבר את תאי הריח לזירה באמצעות צינור פלסטיק.
בדוק את קצב זרימת האוויר בכל רבעון של הזירה באמצעות מד זרימה אלקטרוני. ודא שזרמי האוויר הבקרה והריח פועלים שניהם במהירות של 100 מיליליטר לדקה. זבובים רגישים מאוד לזרימת אוויר, וזה קריטי שזרימת האוויר עבור כל רביע תאומת לפני כל ניסוי.
כעת, נקו את הזירה ואת צלחות הזכוכית באמצעות 70% אתנול. נגב את כל החלקים פעמיים-שלוש, ואפשר להם להתייבש לחלוטין באוויר לפני שתמשיך. לאחר מכן, מהדקים את לוחות הזכוכית לזירה.
לאחר מכן, העבירו את הזבובים לזירה ללא הרדמה. בעזרת כוח הכבידה, הניחו להם להיכנס דרך החור באחת מלוחות הזכוכית, ואז כסו את החור ברשת עגולה. כעת, הנח את הזירה העמוסה בזבובים בתא האטום לאור.
לאחר מכן, חבר את ארבעת זרמי האוויר הבקרה לכל פינת זירה. סגור את דלת החדר ותן לזבובים להתאקלם בסביבה החדשה למשך 10 עד 15 דקות. לאחר תקופת ההתאקלמות, ערכו ניסוי בקרה של חמש עד 10 דקות שבו זבובים נחשפים לארבעה זרמי אוויר בקרה.
כעת חיוני לנתח את הנתונים באופן מיידי. אם הזבובים אינם מפוזרים באופן שווה בזירה, יש לאפס את הזירה. זה קריטי לבדוק את התנהגות זבובי הביקורת רק לאוויר נקי.
פעולה זו תוודא במהירות שכל תנאי הרקע תקינים. אור דולף, חוסר איזון בטמפרטורה, זירה מוטה או זיהום ריח עלולים לגרום לבעיות. במידת הצורך, השליכו את הזבובים ונקו שוב את הזירה.
אם יש חשד לזיהום ריח, החלף את כל הצינורות. המשך לחזור על מבחן הביקורת עם קבוצות חדשות עד שבעלי החיים לא יראו העדפה לאף אחד מארבעת הרבעים. לאחר מכן, חבר את תא הריח לבדיקה להתקנה באמצעות שסתום תלת-כיווני, או חבר מחדש את הצינור והפעל ניסוי בדיקה למשך חמש עד 10 דקות.
להקלטות ניסיוניות ארוכות יותר, עצור במהירות והפעל מחדש את תוכנית המעקב כל 20 דקות, אחרת קבצי הנתונים יהיו גדולים מדי. בין הבדיקות, השליכו את הזבובים, נקו את הזירה ואת לוחות הזכוכית עם אתנול 70% והחליפו את צינורות המחבר. שמור על זרימת האוויר היבשה כדי לשטוף את המערכת ללא הרף.
ליעילות, טוב שיהיו שתי זירות כדי שניתן יהיה לבצע ניקוי במהלך הריצה. אם מספר ניסויים שגויים באותו יום, הקפד מאוד לוודא שלא יישאר ריח במערכת מריצה קודמת. בדרך כלל זו לא בעיה עם ריכוזים נמוכים של ריח או עם CO2, אך עבור גירויים מרוכזים מאוד, ייתכן שיהיה צורך במרווח של עד 24 שעות בין ריצות הניסוי.
לניתוח הנתונים, השתמש בשגרת Matlab המותאמת אישית שסופקה כדי להמיר את הנתונים לפורמט Matlab. טען את קובץ הנתונים הגולמי שנוצר בזמן אמת על ידי תוכנת המעקב, וצור מסיכה מרחבית העוקבת אחר קווי המתאר של הזירה. החל את המסכה על הנתונים הגולמיים כדי להסיר את כל נקודות הנתונים הנופלות מחוץ לזירה, מכיוון שהן מייצגות רעש.
לאחר מכן, הסר את כל נקודות הנתונים שנעות במהירות של פחות מ- 0.163 סנטימטרים לשנייה למשך יותר משלוש שניות. סביר להניח שנתונים אלה הם רעש, או זבובים שאינם זזים. כעת, דמיין את נקודות הנתונים הנותרות על ידי התוויית כולן לאורך תקופות ההקלטה.
ניתן לראות את הנתונים גם כמסלולים בודדים. ניתן להעריך במהירות את גבולות הריח על סמך נתוני התנהגות הזבובים. לאחר מכן, חשב את מדד המשיכה, ובצע בדיקות סטטיסטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
25 זכרים ו-25 נקבות זבובים נבדקו במנגנון ההתנהגותי. בתגובה לאוויר יבש, זבובים חקרו את הזירה כולה ללא העדפה לרבע כלשהו. הקו מראה את המסלול של זבוב אחד.
כאשר חומץ תפוחים הוכנס לזרם האוויר ברביע השמאלי העליון, רוב הזבובים נמשכו לרביע הריח הזה. כאשר הוצג ריח דוחה, 10% אתיל פרופיונט, ברביע השמאלי העליון, הרביע הזה נמנע. המדד האטרקטיבי של רביע זה קיבל ציון של 0.68.
מדד אטרקטיבי הוא המדד הנפוץ ביותר במדידת תגובת ריח. ערך מעל או מתחת לאפס מצביע על משיכה או דחייה. התסריט פיצה על שינויים קלים במיקום הזירה בין הניסיונות.
נקודות נתונים שהיו עשויות להיות רעש או זבובים לא זזים הוסרו. בעוד שניתן להריץ את הבדיקה לכל משך זמן, מעניין לראות את השינויים בתנועות הקבוצה על פני פחים של 10 שניות כדי להעריך הרגלת ריח ותופעות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל ולנתח ביעילות התנהגויות ריח בבדיקת ארבעה שדות.
לאחר השליטה, ניתן להשלים כל ניסוי ריח תוך כשעה, ואנו מריצים באופן שגרתי ארבעה עד שישה ניסויים במהלך יום אחד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מערך התנהגותי ושיטה לניתוח נתונים להערכת תגובות ריח בזבובים של פירות (Drosophila melanogaster). המערכת תוכננה לשימוש עם גירויים ריחניים בודדים או מרובים, וניתן להתאימה למניפולציה אופטוגנטית של תתי-אוכלוסיות של נוירונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- מערכות חושם
רקע
- המחקר מתמקד באופן שבו מערכות עצביות ריחניות מזהות גירויים חיצוניים.
- הבנת פענוח המידע החושי על ידי המוח היא קריטית לקבלת החלטות התנהגותיות.
- מערך האולפקטומטר מאפשר בדיקה מבוקרת של תגובות ריח.
- שיטה זו יכולה להכיל אוכלוסייה גדולה של זבובים לצורך בדיקות חוזרות.
מטרת המחקר
- לבדיקת התנהגויות 후שם של Drosophila melanogaster.
- לחקירת המנגנונים של זיהוי ריח ותגובות התנהגותיות.
- לספק מסגרת ניסויית רב-גונית ואמינה למחקרים עתידיים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש באולפקטומטר בעל ארבעה רבעים לבדיקות התנהגותיות.
- תוכנה אוטומטית למעקב אחר זבובים לצורך איסוף נתונים.
- הכנת תאי ריח בתצורות ספציפיות לבדיקה.
- שילוב של ביקורות ממס לצד חומרי הריח הנבדקים לצורך השוואה.
תוצאות עיקריות
- המערך מאפשר הערכה של תגובות ריח באוכלוסיות גדולות של זבובים.
- מוצגת ורסטיליות בבדיקה עם גירויי ריח שונים.
- איסוף נתונים חסון באמצעות מעקב אוטומטי משפר את המהימנות הניסויית.
- פוטנציאל ליישומים אופטוגנטיים למניפולציה של פעילות נוירונלית במהלך הבדיקות.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מקיפה לחקר התנהגות ריחית ב-Drosophila.
- היא פותחת נתיבים לבחינת הבסיס העצבי של עיבוד ריח.
- ניתן להתאים את המערך לצרכים ניסויים שונים במחקר בתחום מדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מאפשרת הערכה כמותית בתפוקה גבוהה של התנהגויות המונעות על ידי חוש הריח ב-Drosophila, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בנורו-פארמקולוגיה ובמדעי העצבים החושיים. על ידי אספקת תוצרי התנהגות הניתנים לשחזור ומקושרים לתפקוד מעגלים עצביים, היא מקלה על הפחתת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות המערבות עיבוד ריח או מסלולים כימו-חושיים. יכולת ההסתגלות של המערכת למספר גירויים ומודלים גנטיים מגבירה את התועלת שלה בתהליכי גילוי מוקדמים לזיהוי מובילים (leads) ובביטחון חיזוי במעורבות המטרה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מעגלים עצביים ריחניים כדי לתקף מטרות המעורבות במסלולי זיהוי חושי ותגובה התנהגותית.
- ערך תפעולי: תומך בסריקה התנהגותית ברמת אוכלוסייה באמצעות מעקב אוטומטי, מה שמפחית שונות ומגביר את התפוקה לצורך הפחתת סיכונים במטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר מדדי משיכה/דחייה כמותיים המשמשים כקריאות פנוטיפיות עבור קמפיינים של סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- ערך תפעולי: בקרת זרימת אוויר סטנדרטית ותכנון זירה מבטיחים הדירות בין הרצות, מה שמאפשר תיקוף מהימן של הבדיקה עבור יישומים המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר רציפות ממניפולציה של גן או מטרה לפלט התנהגותי מדיד, ובכך תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים תרגומיים בפנוטיפים תחושתיים.
- ערך תפעולי: תואם למודלים גנטיים (למשל, קווים טרנסגניים), ומאפשר הערכה של השפעות knockdown או ביטוי יתר של מטרה על התנהגות מונחית ריח.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לתוצרי התנהגות מדידים, ובכך תומכת במעבר מזיהוי מטרה לוולידציה פנוטיפית.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשר בדיקת השערות לגבי תפקוד מעגלים ריחוניים על ידי מדידת תגובות התנהגותיות בזמן אמת לגירויים מבוקרים.
- סריקה: מספק תנאים סטנדרטיים ומוכנים לבדיקה להערכת קוהורטות גדולות של זבובים תחת אתגרים ריחוניים מוגדרים.
- אנליטיקה: מספק נתוני התנהגות מרחביים וחישובים של מדד משיכה המאפשרים השוואה כמותית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציה עצבית להתנהגות ניתנת לצפייה, ובכך תומך בתוקף פרה-קליני של מטרות במסלולי עיבוד חושי.
- שימוש חוזר ארגוני: התכנון המודולרי של האולפקטומטר מאפשר שימוש חוזר בפרויקטים, גירויים וגנוטיפים מרובים, ובכך מקדם יעילות ברמת הפלטפורמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במערכות יחסי מטרה-התנהגות על ידי הפחתת רעשים באמצעות מעקב אוטומטי וסינון התנהגותי.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות תיקוף קפדני של זרימת האוויר, פרוטוקולי ניקוי של הזירה ובדיקות ניסויי ביקורת.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go בתיקוף מטרות על ידי אספקת פנוטיפים התנהגותיים ברורים וכמותיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על נתוני הפחתת סיכון התנהגותיים ממבחני ריח.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, תכנון מערכי בדיקה התנהגותיים, וניתוח נתונים בסיסי ב-MATLAB או בתוכנה מקבילה.
- תלוי בציוד לוויסות זרימת אוויר, במערכות להזרקת חומרי ריח, ובחומרת מעקב וידאו עם בקרות סביבתיות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הרעבה, ניקוי הזירה וניסויי ביקורת כדי לשלול הטיות מיקומיות או זיהומים.
- חייב להביא בחשבון שיעורי הישרדות ספציפיים לגנוטיפ במהלך הרעבה ולהתאים את הפרוטוקולים בהתאם כדי לשמר את חיוניות הקוהורט.
- מוגבל בשל הצורך בשטיפות תכופות של המערכת ובסכנה לזיהום צולב עם חומרי ריח בריכוז גבוה, מה שדורש זמני השבתה ממושכים בין הרצות.
