מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ניתוח אלקטרו-פיזיולוגי של תא בודד של אוכלוסייה מוגדרת של נוירונים חושיים בפרוסות רקמה חדות מהאיבר הוומרונזאלי של העכבר. שיטה זו יכולה לעזור להבהיר שאלות מפתח בתחום הכימותרפיה, כגון מנגנוני הזיהוי הכימי של לא-לראות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעל ידי הקלטה מנוירונים חושיים בפרוסות רקמה חריפה, ניתן לחקור תאים אלה בסביבתם הטבעית.

כדי להתחיל בהליך זה, לאחר הקרבת החיה, הסר את הלסת התחתונה שלה, על ידי החדרת זוג מספריים כירורגיים גדולים דרך חלל הפה, וחתוך את עצמות הלסת התחתונה והשריר של כל צד בנפרד. לאחר מכן, הסר את עור הלסת העליונה וסביב קצה האף בעזרת מלקחיים בינוניים, כדי לקבל גישה טובה יותר לחותכות. לאחר מכן השתמש במספריים העצם כדי לחתוך את החלק הגדול ביותר של החותכות בזווית של 45 מעלות בכיוון הרוסטרלי כדי להקל על הסרת קפסולת ה-VNO מחלל האף.

אין לחתוך את שורש השן כדי למנוע נזק לקצה קפסולת ה-VNO. לאחר מכן, תפסו את החך העליון הנוקשה בחלקו הרוסטרלי בעזרת מלקחיים בינוניים, וקילפו בזהירות בחתיכה אחת בזווית שטוחה. שטפו שוב ושוב את חלל הצי בתמיסה קרה כקרח S2. לאחר מכן השתמש במספריים מיקרו קפיצים כדי לחתוך את תפליט העצם בין קצה עצם הוומר ללסת.

הכנס את קצות המספריים כשהחלק המעוקל מצביע הרחק מה- VNO. וחתכו בזהירות את העצם בצעדים קטנים בצד שמאל וימין כאחד, לרוחב קפסולת ה- VNO. כדי להסיר את קפסולת ה-VNO, חתכו את עצם הוומר בחלק הזנבי, והרימו בזהירות את עצם הוומר מחלל האף באמצעות מלקחיים בינוניים.

העבירו מיד את ה- VNO לצלחת פטרי קטנה תחת מיקרוסקופ סטריאו על חבילת ג'ל קרח, שם יש לבצע את שאר השלבים של הדיסקציה. לאחר מכן, שטפו את ה-VNO בכמות קטנה של S2 קר כקרח, כדי למנוע את התייבשות הרקמה. לאחר מכן, הפרד את הכמוסות הסחוסיות המכילות את הרקמות הרכות של VNO על ידי אחיזה בחלק האחורי של עצם הוומר בעזרת מלקחיים בינוניים.

לשם כך, מקם את הקפסולה למבט גבי כך שפיצול בין שני ה-VNOs יהיה גלוי. השתמש בקצה המלקחיים העדינים כדי להפריד את שתי כמוסות ה-VNO של הסחוס מהעצם המרכזית, תוך שמירה על עצם הוומר מוצמדת כלפי מטה בחלק האחורי. ודא שדופן הסחוס המדיאלי שהיה מחובר בעבר לעצם הוומר מוסר.

בעת הסרת סחוס סביב ה- VNO השתמש במלקחיים רק בשולי קפסולת הסחוס. והקפידו מאוד לא לפגוע באפיתל החושי העדין. כדי להסיר את הסחוס שנותר, סובב את ה- VNO עם הצד הצדדי המעוקל שלו לתחתית הכלי והצמד היטב את הסחוס בצד אחד בעזרת מלקחיים.

לאחר מכן הזיזו בזהירות את המלקחיים העדינים השניים מהצד האחורי בזווית שטוחה מאוד בין הסחוס ל-VNO כדי לשחרר את הקשר בין הרקמה לסחוס. כדי למנוע נזק לאפיתל החושי, קלף לאט את ה-VNO מהסחוס על ידי החזקתו בקצה הזנב שלו. לאחר מינוף ה-VNO מהקפסולה, הסר את כל חלקי הסחוס הקטנים שנותרו מכיוון שכל פיסות הסחוס שנותרו ינתקו את הרקמה מהאגרוז שמסביב במהלך תהליך החיתוך.

לאחר מכן, הניחו טיפה קטנה של S2 קר כקרח על ה-VNO המנותח הראשון כדי למנוע נזק לרקמות. כדי להטמיע את ה-VNOs, מלאו את שתי צלחות הפטרי הקטנות עד השפה ב-S3 מותך. לאחר מכן, טבלו כל VNO באגרוז והזיזו אותו אופקית קדימה ואחורה מספר פעמים כדי להסיר את הסרט של תמיסה חוץ-תאית כמו גם כל בועות אוויר מפני השטח שלו. מקם את ה- VNO בצורה אנכית, כאשר קצה הרוסטרל פונה לתחתית המנה.

לאחר מכן, הניחו את שתי המנות על שקית קרח ג'ל, והמתינו עד שהאגרוז יתמצק. אל תשנה את כיוון ה-VNO לאחר שהאגרוז החל להתמצק, מכיוון שהדבר ינתק את הרקמה מהאגרוז שמסביב. בהליך זה, השתמש במרית קטנה כדי להסיר את גוש האגרוז מהצלחת הקטנה למכסה של צלחת פטרי גדולה, והפוך את האגרוז הפוך, והשאיר את קצה האגרוז של ה- VNO כלפי מעלה.

לאחר מכן, חותכים את הבלוק לצורת פירמידה באמצעות אזמל כירורגי, והקפידו לא לפגוע ברקמה המוטבעת. לאחר מכן, השתמש בדבק סופר כדי לקבע את הבלוק בצורת פירמידה למרכז לוחית דגימת הוויברטום. והמתן כדקה עד שהדבק יתייבש לחלוטין.

פורסים את הדגימה לחלקים בעובי 150 עד 200 מיקרומטר. בדוק בקצרה את מורפולוגיה הפרוסה תחת מיקרוסקופ הניתוח. לאחר מכן העבירו את כל הפרוסות לתא החמצון עד לשימוש.

בשלב זה, העבירו פרוסת VNO לתא ההדמיה וקבעו את מיקום הפרוסה באמצעות עוגן נירוסטה המחובר לסיבים סינתטיים בעובי של מילומטר אחד. אין לכסות את פרוסת הרקמה באף אחד מחוטי הסיבים הסינתטיים. לאחר מכן, העבירו את תא ההדמיה למערך ההקלטה והיכו ברציפות את הפרוסה עם S2 מחומצן בטמפרטורת החדר.

התאם את נימי היניקה לפני השטח של התמיסה כדי ליצור החלפה מתמדת של תמיסת אמבטיה. לאחר מכן כוונן את שמונה בעיפרון השפע הרב-חבית אחד מעל וקרוב לחלק הלא חושי של פרוסת ה-VNO המכילה את כלי הדם. לאחר מכן חבר את אלקטרודת הייחוס ותמיסת האמבטיה באמצעות גשר אגר בצורת L מלא באשלגן כלורי 150 מילימולר.

לאחר מכן מלאו את פיפטת התיקון בתמיסת פיפטה S4. התקן את הפיפטה מעל האלקטרודה המצופה כלוריד כסף המחוברת לראש tagמבלי לגרד את הציפוי והצמד בחוזקה. לאחר מכן הפעל לחץ חיובי קל על פיפטת התיקון לפני הכניסה לאמבטיה. עקוב אחר הפיפטה וודא שהיא בין ארבעה מגה-אוהם ל-10 מגה-אוהם.

דמיין את פרוסת ה-VNO עם מצלמת CCD באמצעות DIC מותאם לאינפרא אדום, וזהה תאים המבטאים FPR-rs3 i-Venus או נוירונים בעלי תוויות דומות באמצעות תאורת פלורסנט וקוביית פילטר מתאימה. התקרב לגוף התא באמצעות גלגלי יד לרגישות מרבית. בשל הלחץ החיובי, שקע קטן בקרום הסומה של התא נראה ברגע שקצה הפיפטה נמצא בקרבת מקום.

לאחר מכן שחרר את הלחץ החיובי והפעל לחץ שלילי קל כדי לשאוב את קרום התא על מנת להשיג אטימה בעלת התנגדות גבוהה של 1 עד 20 ג'יגה-אוהם. לאחר מכן הפעל יניקה קצרה ועדינה כדי לשבש את קרום התא ולבסס את כל תצורת התא. באיור זה, תמונה קונפוקלית של פרוסת רקמת VNO קורונלית מציגה את התפלגות הנוירונים החיוביים הפלואורסצנטיים FPR-rs3 Tau Venus באפיתל החושי הוומרונזלי.

הנוירונים החיוביים של FPR-rs3 Tau Venus מציגים דנדריט אפיקלי יחיד המסתיים במבנה דמוי כפתור בגבול הלומינלי. ומוצגות כאן הקלטות מהדק תיקון התא השלם שבוצעו מסומה VSN. להלן העקבות המייצגים מהקלטות מהדק תיקון סיטונאי של זרם נתרן מפעיל מהיר רגיש ל-TTX, ו-VSNs חיוביים FPR-rs3.

הקלטות צעד מתח בתנאי בקרה חושפות זרם פנימי מהיר וחולף תלוי מתח. טיפול ב-TTX במיקרוטולר אחד מפחית מאוד את הזרם. והעקבות המופחתות דיגיטלית המוצגות כאן חושפות את זרם הנתרן הרגיש למתח TTX.

עקבות מהדק הזרם המייצג מראים דפולריזציה וקיטוב יתר וקווי פעולה פוטנציאליים הנוצרים בהזרקת זרם חיובי ושלילי בשלבים. לאחר השליטה, ניתן לבצע את כל תהליך החיתוך וחיתוך הרקמות תוך כשעה עבור שני ה-VNO. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הקלטות טלאים רופפים חוץ-תאיים או הדמיית סידן על מנת להגדיל את התפוקה בעת ניתוח אוכלוסיות גדולות יותר של נוירונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור פרוסות רקמה חריפות מהאיבר הוומרונזאלי של הפה, וכיצד לבצע הקלטות אלקטרו-פיזיולוגיות של תא בודד מנוירונים חושיים וומרונזאליים.