הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice
6 בדצמבר 2011
בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO). כאן, רקמה חריפה פרוסה הכנת VNO לביצוע הדמיה סידן מתואר. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות subpopulations ו / או נוירונים בודדים ברקמה חיה נוח זיהוי קולטן ליגנד.
המטרה הכללית של הליך זה היא להכין פלחים חיוניים של רקמה מהאיבר האפי של העכבר (RO nasal organ) או מהאיבר הנזאלי ה-VNO, במטרה לבצע ניסויי דימיון סידן (calcium imaging) על תתי-אוכלוסיות של נוירונים או על נוירונים בודדים ברקמה חיה. זאת משיגים תחילה על ידי הוצאת ה-VNO מאפו של העכבר, ולאחר מכן על ידי מיקרו-דיסקציה מהקפסולה הסחוסית שלו תחת מיקרוסקופ דיסקציה ב-A CSF קר. לאחר מכן, ה-VNO המבודד ממוקם בצורה אנכית בתוך בלוק אגר, ופלחי רקמה קורונליים חיוניים נחתכים באמצעות מיקרוטום כדי לוודא את שלמות הרקמה.
מספר פרוסות נבחנות לאחר אימונוהיסטוכימיה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. פרוסות אחרות טוענות בצבע רגיש לסידן ולאחר מכן מופעל בהן פירפור של ליגנדים פרומנליים משוערים, והפעלה עצבית נצפית באמצעות דימוי סידן. שיטה זו יכולה לסייע בפתרון סוגיות מרכזיות בתחום הריח.
לדוגמה, מאות קולטני פרומונים מבוטאים באיבר האף של ה-romo, אך למיעטם בלבד זוהו ליגנדים. קולטני פרומונים קשים מאוד לביטוי במערכת הטרוגנית. נדרשנו לפתח בדיקת in vivo יעילה כדי לשייך פרומונים ספציפיים לקולטנים ספציפיים.
ניתן להשתמש בעכברי tact שבהם תת-אוכלוסייה ספציפית של נוירונים מבטאת רצפטורים לא ידועים וניתן לזהותה באמצעות ביטוי של GFP. נוכל להשתמש בבדיקה זו גם כדי לחקור באופן פרמקולוגי תעלות יונים ואנזימים המעורבים במסלול העברת האותים של Fairmont תוך הדגמת הפרוצדורה. היום ילוו אותנו ג'וליאן ופביאן, שני חוקרים מהמעבדה שלי, לפני תחילת הניתוח.
הכינו נוזל חוט שדרה מלאכותי (CSF) טרי וקר, הרוויח ב-oxy carb, על ידי ערבוב של כל הרכיבים למעט סידן כלוריד. הרוויחו את התמיסה על ידי הבעבוע ישיר של oxy carb בתוכה. לאחר מכן, הוסיפו את הסידן כלוריד והביאו לנפח הרצוי באמצעות מים מזוקקים פעמיים.
יש לשמור את תמיסת ה-A CSF על קרח עד לשימוש. לאחר ביצוע הרדמה וה decapitation לעכבר בוגר, הכין צלחת פטרי עם A CSF קר המועשר ברצף בחמצן ופחמן דו-חמצני. לאחר הסרת הלסת התחתונה, הנח את ראש העכבר לצלחת הפטרי.
מקם את ראש העכבר תחת מיקרוסקופ הדיסקציה כדי לדמיין את החיך. לאחר מכן, בצע חתך אופקי בחלקו העליון של החיך באמצעות מיקרו-מספריים ולאחר מכן הסר את קרומי החיך בעזרת פינצטת מיקרו-דיסקציה. הרטב ונקה את החלל החשוף באמצעות A CSF.
גזרו את החלקים העליון והתחתון של מחיצת האף. לאחר מכן, הוציאו בעדינות את מחיצת האף המכילה את ה-VNO והניחו אותה בצורה אנכית ישירות לתוך A CSF נקי. הפרידו בין שני חלקי ה-VNO באמצעות פינצטת מיקרו-דיסקציה.
זהו את הקפסולה הסחוסית של ה-VNO והסירה אותה בעדינות, תוך וידוא שכל חלקי הסחוס הוסרו. ה-VNO המבודד, חלקי הסחוס וה-VNO שלא נשחם מצויים כאן תחילה; הכן agarose בריכוז 3% עם נקודת התכה נמוכה, ולאחר מכן ארגן את סביבת העבודה עם הכלים הדרושים. מלא את תבנית ההטמעה ב-agarose וודא שהטמפרטורה נמוכה מ-41 °C לפני טבילת ה-VNO שנשחם. מקם את הרקמה בצורה אנכית כדי להוציא חתכים קורונליים.
הניחו את תבנית הטבילה על קרח למשך דקה אחת עד להת굳דות האגר. לאחר דקה, הוציאו את בלוק האגר, גזרו את האגר לצורת פירמידה, ואז הדביקו אותו לתמיכה של המיקרוטום. בצעו חיתוכי שכבתיים (coronal) של ה-VNO במיקרוטום במהירות של 0.5 מילימטר לשנייה, באמפליטודה של 0.7 מילימטר ובקושי של 100 מיקרומטר ב-CSF קר.
אספו את פרוסות הרקמה באמצעות מברשת והניחו אותן בתוך פלטת תרבית רקמה מלאה ב-A CSF קר, וזאת כדי לוודא כי ניתן לקבע את השלמות המבנית של פרוסות הרקמה שנאספו ולאחר מכן לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית לרכיבי השלד התאי או לחלבונים אחרים רלוונטיים. כאן, צביעה אימונוהיסטוכימית נגד acetylated tubulin בצבע סגול מדגימה את השלמות המבנית של פרוסת הרקמה. יתרה מכך, תצפית על אוכלוסיית נוירונים ספציפית שבה רצפטור פרומוני מסוים סומן על ידי GFP מראה מורפולוגיה נוירונית נשמרת; בעבודה בחדר חשוך ניתן להבחין בנוירונים בעלי גופי תא אובליים קטנים ודנדריטים ארוכים המגיעים לפני השטח של הלומן ומסתיימים במיקרווילוסים.
דגרו פרוסות VNO בתמיסת טעינה של A CSF קר עם 7 µM URA 2:00 AM ו-0.1% onic למשך שעה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שעה, שמרו את הפרוסות הטעונות על קרח תחת חימחמון (oxy carbonation) עד לשימוש. השתמשו במכחול כדי להעביר את הפרוסות הטעונות לתא פרפוזיה המכיל A CSF והדקו את הפרוסות באמצעות מעגן לפרוסות רקמה.
הניחו את תא הפרפוזיה על במה המיקרוסקופ של מערכת לדימות סידן ובצעו פרפוזיה רציפה של A CSF מחומצן ומפחמן בטמפרטורת החדר. צפו בפרוסות ה-VNO הטעונות תוך שימוש באורכי גל פלואורסצנציה המתאימים לצבע, שהם 403 עד 803 ננומטר עבור four O 2:00 AM. השתמשו בתוכנה המתאימה כדי להקליט שינויים ביחס הסידן התוך-תאי. מערכת פרפוזיה נחוצה כדי להשריע גירוי כימי.
כאן מוצג פרוס קורונלי של רקמת vno מעכבר, שבו תת-אוכלוסיית הנוירונים המבטאים את קולטן הפרומון V one RB two מבטאת גם GFP, אשר נצבע בשיטת אימונו-סמיכה כנגד חלבון acetylated tubulin המופיע בצבע סגול. תצפיות בהגדלה גבוהה יותר של הפרוסה מדגימות את השמירה על שלמות הרקמה. ניתן לראות נוירונים בעלי דנדריטים ארוכים המגיעים לפני השטח של הלומן, וניתן להבחין בביטוי של החלבון המבני בבליטות הדנדריטיות (dendritic knobs) ובמיקרוויליי עבור דימוי סידן.
פרוסות רקמה טעונות ב-FU מודגשות תחילה באמצעות מיקרוסקופ פאזה של הופמן (Hoffman phase contrast) כדי לאתר את השדה המבוקש; החל מכלי הדם, החץ הלבן הראשון, המתבונן מתקדם באיטיות לעבר הלומן, החץ הלבן השני, והאזור הנוירו-אפיתליאלי. ניתן לזהות את גוף התא הסגלגל של נוירון אפיתל האף של ה-RO על ידי הדנדריט הארוך והדק שלו, המסומן בחץ הלבן השלישי.
החץ הלבן הרביעי המשתרע אל תוך הלומן, הפ팅 הדנדריטי העצבי. החץ הלבן החמישי מצביע על מיקרוויליי (microvilli) במגע עם תאים טעוני פרומונים RA; כאן הם מוצגים ב-3 80 nanometers, ולאחר מכן מוארים ברצף ב-3 40 ו-3 80 nanometers, ויחס אורך גל פלואורסצנטי זה תואם לשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי בנוירונים שנבחרו, העיגולים השחורים, האדומים והכחולים. נעשה שימוש ב-ATP כדי לקבוע את חיוניות הנוירונים.
שימו לב למגוון תגובות הסידן שהופגנו בשלושת הנוירונים שנבחרו, ולעובדה שנוירון מספר שתיים (במעגל האדום) אינו מגיב ל-TP ולכן יוצא מהמשך הניתוח. גירוי כימי מבוצע לאחר מכן באמצעות שתן ומעברון של פרומונים של עכבר, תוך בחינה של עומק פרוסת הרקמה. ניתן לאתר תת-אוכלוסייה של נוירונים המבטאים הן GFP והן את הקולט V1RR2.
כאן מוצג נוירון המבטא הן GFP והן את הקולטן V1RB2, לצד נוירון שאינו מבטא V1RB2. שני התאים טעונים ב-URA 2:00 AM, והנוירון המבטא V1RB2 מראה שיא רמת סידן בתגובה לבישור של הליגנד של הקולטן, 2-hep-known. באופן מעניין, גם הנוירון שאינו מבטא V1RB2 מגיב ל-2-hep-known, מה שמדגים את המורכבות של קידוד הפרומונים ב-VNO.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן מיצוי המיקרו-דיסקציה של איבר תאי ה-mar בעכבר לצורך הכנת פרוסות רקמה חדות. פרוטוקול זה ניתן להתאימו גם למחקר פיזיולוגי תוך שימוש בצבעי סידן חלופיים ובמערכי מיקרוסקופ שונים. בהצלחה בניסוי שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להכנת פרוסות רקמה חיות של האיבר הוומרונזלי (VNO) בעכברים לצורך דימוי סידן. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לצפות בנוירונים בודדים ובתגובותיהם לליגנדים פרומונליים ברקמה חיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחקר ריח
- דימוי סידן
רקע
- האיבר הוומרונזלי (VNO) חיוני לזיהוי פרומונים בעכברים.
- דימות סידן הוא כלי רב עוצמה לחקר פעילות נוירונלית.
- זיהוי אינטראקציות בין קולטן לליגנד חיוני להבנת איתות פרומוני.
- קולטני פרומונים רבים נותרו ללא אפיון בשל קשיים במערכות ביטוי.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה אמינה להכנת פרוסות VNO לצורך דימוי סידן.
- בחינת התגובות של אוכלוסיות עצביות ספציפיות לליגנדים פרומונליים.
- סיוע בזיהוי זוגות רספטור-ליגנד באותות פרומונליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפקה ומיקרו-דיסקציה של ה-VNO מרקמת עכבר.
- הכנת חתכים קורונליים חדים באמצעות מיקרוטום.
- אימונוהיסטוכימיה לאימות שלמות הרקמה.
- דימוי סידן לצפייה בהפעלה נוירונלית בתגובה לליגנדים.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של פרוסות VNO השומרות על השלמות המבנית.
- זיהוי של אוכלוסיות נוירונליות ספציפיות המבטאות רצפטורים לפרומונים.
- הדגמה של טכניקות דימות סידן לניטור פעילות נוירונלית.
- פוטנציאל לפתרון סוגיות מרכזיות במחקרים על חוש הריח.
מסקנות
- השיטה המתוארת מספקת כלי בעל ערך לחקר אותות פרומונליים.
- דימות סידן של פרוסות VNO יכול לשפר את ההבנה של מנגנונים ריחוניים.
- גישה זו עשויה להוביל לזיהוי של קולטני פרומונים שאינם ידועים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על תגובות נוירונליות לליגנדים פרומונליים ברקמה חיה, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות (target validation) במחקרי ריח ונוירופרמקולוגיה. על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה הטבעית ואפשרות לדימות סידן ספציפי לליגנד, היא מספקת מערכת רלוונטית פיזיולוגית להפחתת סיכונים בהשערות לגבי מטרות בשלב מוקדם של הגילוי. גישה זו נותנת מענה לצוואר בקבוק מרכזי בשיוך ליגנדים לרצפטורים יתומים, ובכך משפרת את הביטחון הניבוי במגמה של בחירת מטרות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור רספטורים ספציפיים לפרומונים לסליגנדים שלהם ברקמה טבעית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על הפעלה עצבית בתגובה לסליגנדים משוערים.
- ערך ניבוי: מסייע בזיהוי מועמדים פוטנציאליים (leads) על ידי אישור אינטראקציות רספטור-סליגנד במערכת חושית רלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנת פרוסות רקמה ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סריקה המשכית של תרכובות פרומונליות.
- פלט כמותי: מאפשר דימות סידן רציומטרי למדידת תגובות עצביות תלויות-מינון.
- שחזוריות: הכנה סטנדרטית של פרוסות תומכת בקבלת תוצאות עקביות בין ניסויים ומעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש ב-VNO של עכבר כמודל לחקר מסלולים כימו-סנסוריים הרלוונטיים להפרעות התנהגותיות ונוירולוגיות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro לפיזיולוגיה של רקמה שלמה, ובכך משפר את הערך החזוי לתוצאות in vivo.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר בירור פרמקולוגי של תעלות יונים ומסלולי איתות המעורבים בהעברה של פרומון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף של שלבי הגילוי המוקדמים, ותומכת בתיקוף המטרה לפני שלבי פיתוח הבדיקה ואופטימיזציה של המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה של פעילות עצבית המושרית על ידי ליגנדים ברקמת VNO מקורית.
- סריקה: מייצרת תכשירי רקמה המתאימים לסריקת ספריות תרכובות כנגד נוירונים ספציפיים המבטאים רצפטורים לפרומונים.
- אנליזה: מספקת מדידות כמותיות של שטף סידן המאפשרות השוואה של עוצמת הליגנד ויעילותו בין תת-אוכלוסיות של נוירונים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רלוונטיות פיזיולוגית, ובכך מסייעת בהסברה (extrapolation) למודלים התנהגותיים ופרה-קליניים.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת פלטפורמה רב-פעמית לחקר זוגות רצפטור-ליגנד מרובים במערכת הוומרונזלית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי אישור אינטראקציות תפקודיות בין רצפטור לליגנד ברקמה חיה.
- ערך תפעולי: מספק הכנה סטנדרטית וניתנת לשחזור לדימוי סידן במערכי ליגנדים ובמודלים גנטיים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת אי-הוודאות במנגנון המטרה ובספציפיות של הליגנד.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם-סיכון עם מעורבות ליגנד מאומתת במערכת רלוונטית פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות, חיתוך במיקרוטום ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בגישה לקריוסטט, תא פרפוזיה ומערכת לדימות סידן עם סטים מתאימים של מסננים.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרפוזיית ACSF ושל פרוטוקול טעינת הצבע בכלל המשתמשים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש התאמות בזווית ובבעובי החיתוך עקב הבדלים אנטומיים.
- מוגבל על ידי משך חיוניות הרקמה, דבר המחייב ביצוע ניסויים בזמן קצר לאחר הכנת הפרוסות.
