Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר ביצוע של ניסויי הצלה לאחר דלדול (depletion rescue) תחת תנאים המשמרים את השלמות התאית ואת ההומאוסטזיס של החלבונים, לצורך ניתוחים פונקציונליים של תהליכים ביולוגיים ברמת התא הבודד.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לתפקודי חלבונים ולדרישות מבניות בדינמיקה של תאים, כגון מיטוזה ודיפרנציאציה של תאים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להדליל חלבון מsיועד ולהחדיר במקביל גרסה שונה של חלבון זה ברמה קרובה לרמה הפיזיולוגית ברוב אוכלוסיית התאים.

התחילו בציפוי של צלחונות בעלי תחתית זכוכית בפיברונקטין. לשם כך, דללו תמיסת מלאי של פיברונקטין בריכוז של mg/mL 1 בדילול של 1:100 ב-PBS סטרילי.

הוסיפו 1 mL לכל צלחת של 35 mL כדי לכסות את כל השטח. דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. במהלך הדגירה, חממו מראש alpha MEM מועשר ב-10% FBS ואליקוואט של 0.05% trypsin EDTA לטמפרטורה של 37 °C.

לאחר 45 דקות של דגירה, התחילו בהכנת תמיסת התאים. שאבו את המצע מלוח של 10 סנטימטרים של תאי HeLa-RFP-H2B, ושטפו בעדינות פעמיים עם 1.5 מיליליטר של 0.05% trypsin EDTA.

השאירו 0.5 milliliters של trypsin EDTA על הפלטה לאחר השאיבה האחרונה, ודגרו את התאים למשך שתי עד שלוש דקות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide.

הקישו בעדינות על הפלטה ובחנו את שכבת התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שכל התאים ניתקו. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של מדיום ובצעו פיפטינג בעדינות מספר פעמים כדי להפריד את התאים, והעבירו את תרחיף התאים לשפופרת של 15 milliliter.

ספרו דגימה של 10 µL מת сусלול התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, שאבו את תמיסת הפיברונקטין מהצלחות בעלות הבסיס מזכוכית. אין לאפשר לפיברונקטין להתייבש לפני זריעת התאים.

הכינו תמיסת תרחיף תאים לזריעה של 1.5 × 10⁵ תאים לכל צלחת של 35 מילימטר בשני מיליליטר של מצע גידול. זרעו צלחת אחת של 35 מילימטר נוספת למספר התנאים על מנת לספור את מספר התאים לפני התהליך של התעתוק הווירוסלי (virus transduction). דגרו למשך 30 עד 45 דקות. לאחר סיום זמן הדגירה, בדקו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מופרדים היטב, כפי שניתן לראות כאן. החזירו את הצלחות לאינקובטור וגדלו את התאים עד למחרת.

ביום שאחרי הזריעה, ודאו שהתאים הגיעו לצפיפות של לפחות 50%. צפיפות תאים נמוכה מ-50% גורמת לירידה ביעילות הטרנסדוקציה של הווירוס, להגדלת השונות בביטוי החלבון לכל תא ולעלייה ברעילות התאים. לאחר מכן, קצרו את התאים מהצלחת הנוספת שנזרעה כפי שנעשה קודם לכן וספרו את מספר התאים. חשבו את נפח הווירוסים הדרוש לטרנסדוקציה יעילה של התאים. סמנו מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter עבור כל תנאי, והוסיפו 400 microliters של alpha MEM minus חם. לאחר הפסקה איטית של מנות הווירוסים על קרח, הוסיפו את הנפח הדרוש מכל וירוס למבחנות וערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג. לאחר מכן, לאחר שאיבת המצע מהתאים, הוסיפו בעדינות את תערובת הווירוסים בטפטוף. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5% carbon dioxide. מדי 15 דקות למשך שעה אחת, נערו את הצלחות בזהירות תחת מכן סטרילי כדי לכסות את התאים בווירוס. שימוש בכמות קטנה של מצע מקל על המגע של הווירוס עם התאים.

לאחר הדגירה, העבירו בעדינות בעזרת פפפט 1.6 milliliters של alpha MEM minus לכל צלחית כדי להגיע לנפח כולל של שני milliliters. לאחר מכן, התחילו בסנכרון התאים על ידי הוספת שני millimolar thymidine לפני הדגירה של התאים למשך שעתיים נוספות.

במקביל, הכינו את תערובת הטרנספקציה של ה-siRNA על ידי הוספה למקרו-מבחנה של 139 µL מים סטריליים, 50 µL של calcium chloride בריכוז 1 M, ו-11 µL של siRNA בריכוז 20 µM. אם אין צורך ב-siRNA, החליפו את כמות ה-siRNA במים סטריליים לצורך ביצוע טרנספקציה ריקה. הוסיפו תמיסת HBSS-2X בטיפות באיטיות לתערובת ה-calcium chloride וה-siRNA. ערבבו בעדינות פעמיים על ידי הזרקת אוויר באמצעות פיפטה של 200 µL, שכן משקעים קטנים יותר מובילים ליעילות טרנספקציה גבוהה יותר. לאחר מכן, דגרו את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הוסיפו באיטיות 200 µL בטיפות לכל צלחת וערבבו. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C, ו-5% carbon dioxide למשך 16 שעות.

ביום למחרת, הוצא את הכליות מהאינקובטור והעבר אותן למנדף לתרביות רקמה. לאחר שטיפת התאים פעמיים עם שני מיליליטר של HEPES חם, הוסף שני מיליליטר של alpha MEM minus לפני ההחזרה לאינקובטור.

שבע שעות לאחר מכן, הוסיפו תימידין בריכוז של two millimolar לצלחות לפני השבתן לאינקובטור. עבדו עם לא יותר מארבע צלחות תאים בו-זמנית, שכן שינויים בטמפרטורה משפיעים על אורך מחזור התא. למחרת, 48 שעות לאחר הטרנספקציה של siRNA והדבקה בנגיף, שטפו את התאים פעמיים עם two milliliters של PBS חמים, ולאחר מכן הוסיפו two milliliters של alpha MEM ללא phenol red לצורך דימות תאים חיים. דגרו למשך שבע שעות.

בצע ניסויי דימות תאים חיים לטווח קצר בתאי מיטוזה באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד בתא תרמו-ווסת עם לחות ו-5% carbon dioxide. לפני הרכישה, וודא שהתא הגיע לטמפרטורה המתאימה של 37 degrees Celsius.

הניחו את צלחות התרבית בתא המיקרוסקופ שעה אחת לפני הרכישה כדי לאפשר שיווי משקל תקין של המצע ולמנוע סטיות במיקוד (focus drifting) עקב שינויי טמפרטורה. בחנו את המצב המיטוטי של התאים. בשלב זה, 10% עד 15% מהתאים צריכים להיות בשלבים מוקדמים של מיטוזה.

במהלך זמן ההשמה (equilibration), הגדירו את פרמטרי הרכישה כפי שנקבע בניסויים קודמים. חשוב להשיג רזולוציה מתאימה ללא פוטו-בליצ'ינג (photo-bleaching), שכן תהליך זה גורם לנזק לתאים ומערער את התקדמות המיטוזה. בחרו מספר שדות המכילים תאים הנמצאים בכניסה למיטוזה עבור כל תנאי, כדי להשיג מספר משמעותי של תאים לניתוח מבלי לחרוג מרווח הזמנים של הרכישה. לאחר בחירת כל השדות, אתחלו את המיקוד והתחילו את הרכישה במהירות המרבית.

בשימוש במערכת קונפוקלית בעלת דיסקה מסתובבת (spinning disc confocal system), מערך טיפוסי יכלול ארבעה תנאים שונים, שבעה שדות לכל פלטה, ושני ערוצי צבע עם מרווח של 1.5 עד שתי דקות לאורך תקופה של 75 דקות. הגדירו קריטריונים ברורים לניתוח פנוטיפים מיטוטיים בתאים, אשר יהיו תלויים בסממנים הפלואורסצנטיים שבהם נעשה שימוש.

בניגוד לטרנספקציה של BAG3-GFP באמצעות DNA פלסמידי, כפי שניתן לראות משמאל, אדנופקציה (adenofection) עם אדנו-וירוסים רקומביננטיים המוצגים כאן מימין, מאפשרת ביטוי הומוגני ויעיל יותר של BAG3-GFP ברוב אוכלוסיית התאים בריבוי הדבקה (multiplicity of infection) נמוך. Western blot מייצג זה מראה כי אדנופקציה עם siRNAs ספציפיים ל-BAG3 ואדנו-וירוס רקומביננטי של BAG3-GFP מאפשרת דלטרציה יעילה של BAG3 אנדוגני והחדרה מחדש של חלבון BAG3-GFP ברמות הקרובות לרמות האנדוגניות. כפי שמוצג כאן, אדנופקציה יכולה לשמר את ההומאוסטזיס של החלבונים, שכן לא נצפתה עלייה ברמות של חלבוני הלם חום המושרים על ידי סטרס בתאי HeLa שעברו אדנופקציה, בניגוד לתאי HeLa שטופלו ב-MG132, המשרה סטרס פרוטאו-טוקסי. כאן ניתן לראות כי התקדמות התאים דרך המיטוזה אינה מופרעת באופן משמעותי על ידי אדנופקציה, כפי שעולה מדימויי time-lapse קונפוקאליים אלו של תאי HeLa שעברו אדנופקציה עם siRNA של בקרה, BacMam-GFP alpha Tubulin ו-BacMam-RFP Actin.

הגרף מצביע על פרופורציית התאים עם מיטוזה לא תקינה. תאים שעברו טרנספקציה עם siRNA ספציפי ל-BAG3 בלבד הראו עלייה של פי שניים בערך ברמת הפגמים המיטוטיים, כפי שמתואר על ידי הפס czerwון, אשר הוחזרה לרמה קרובה לזו של תאי הביקורת על ידי הכנסה מחדש של BAG3-GFP, המוצגת על ידי הפס השחור.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה על אופן ביצוע ניסויי הצלה לאחר דה-פלציה (depletion rescue) באמצעות אדנופקציה (adenofection). שיטה זו מספקת מערכת מהירה ופשוטה ליצירת נוק-דאונים היפומורפיים (hypomorphic knock-downs) לצורך אנליזה של מבנה ותפקוד ברקעים תאיים מרובים. באמצעות שיטה זו, ניתן לזהות דרישות מבניות מרכזיות בחלבון הנחקר עבור תפקוד נתון. לאחר מכן, ניתן להשתמש בגישות אחרות לעריכה גנומית כדי להעמיק את הבנת המכניקה המעורבת.