שב וקיפל תאיים Assay

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד קיפול מחדש של חלבון תוך-תאי התלוי בליווי (chaperone) לאחר הלם חום. באמצעות רפורטר לוסיפרז, בצע תחילה טרנספקציה לתאים עם פלסמידים המקודדים לגן הרפורטר של הלוסיפרז ולחלבון הליווי המבוקש. לאחר מכן, חלק את התאים שעברו טרנספקציה לנקודות זמן של התאוששות בהתאם למערך הניסויי.

ביום למחרת, בצעו הלם חום לתאים כדי להשראת פתיחה של קיפולי החלבון (protein unfolding). המתינו להחלמה כדי להחזיר את קיפול החלבון התוך-תאי, ולאחר מכן מדדו את פעילות ה-luciferase reporter. התוצאות מודדות קיפול מחדש של חלבון התלוי בזמן ובתלויי-lyaperone, על בסיס בדיקת ה-luciferase.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת קיפול מחדש in vitro, הוא האפשרות לקבל מדד פיזיולוגי להשפעת תרכובות או חלבונים על פעילות השפרונים. ההשלכות של טכניקה זו משתמעות לטיפול במגוון רחב של מחלות, כגון מחלות נוירודגנרטיביות או סרטן, מכיוון ששפרונים ממלאים תפקיד חשוב בהתפתחות פתולוגיות אלו. ראשית, חממו מראש את מצע התרבית, את ה-PBS ואת ה-trypsin ל-37 °C במסבך מים.

שטפו תרבית הופעתה (confluent) של תאי HEK 2 93 בעזרת חמישה מיליליטר של PBS. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של trypsin המכיל 0.025%EDTA, סובבו בעדינות את הפלטה להבטחת פיזור אחיד של ה-trypsin והדריכו (incubate) בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. נערו את הפלטה מעת לעת כדי לוודא את ניתוק התאים.

כעת השעיו שוב את התאים ב-10 milliliters של מצע DMEM מלא והעבירו למבחנה מסוג falcon בנפח 50 milliliters. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות מונה תאים של Beckman. זרעו את התאים בצפיפות של כ-60 עד 70% והדגירו למשך שש עד שמונה שעות.

הביאו את Reagent Nine של Extreme Gene לטמפרטורת החדר ואת המנה של המדיום ללא סרום ל-37 °C. העבירו בעזרת פיפט את המדיום ללא סרום לשני נבובות Eppendorf. לאחר מכן, הוסיפו את Reagent Nine של Extreme Gene מבלי לגעת בדפנות הנבובת והדגרימו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בינתיים, הכינו את תערובות הטרנספקציה של 2D NA במבחנה אחת, והוסיפו ran vanilla firefly ובקרת וקטור ריק במבחנה שנייה. הוסיפו את ran vanilla firefly ואת המלווה המולקולרי (molecular chaperone). הוסיפו את ה-DNA לתערובת רכיב הטרנספקציה, ערבבו במערבל (vortex) והדאירו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

המשיכו להוסיף תערובת זו לתאים המגודלים בצלחות והדגירו למשך 24 שעות. קצרו את התאים שעברו טרנספקציה באמצעות trypsin; זרעו תאים בצפיפות של 60% עד 70% בצלחות בעלות שישה בארות, והשאירו אותם באינקובטור למשך הלילה. שאבו את המצע מהתאים שעברו טרנספקציה.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של באפר הלם חום (heat shock buffer) והדגירו למשך 30 דקות. כדי לעצור סינתזה של חלבונים דה-נובו (Denovo), אטמו את המכסים באמצעות רצועות פאראפילם והדגירו במקלח מים בטמפרטורה של 45 °C למשך 30 דקות. כעת הסירו את הפאראפילם והחזירו את התאים לאינקובטור להתאוששות בנקודות הזמן שצוינו.

קצרו את התאים ושטפו אותם פעם אחת ב-PBS. כדי להשיג ליסיס יעיל של התאים, הקפיאו את משקע התאים בחנקן נוזלי, והוסיפו 200 microliters של passive lysis buffer מדולל. כעת חלקו את הדגימות לשלוש חזרות (triplicates). העבירו 30 microliters של ליזאט התאים לכל באער בלוח של 96 באערים.

על מנת להעריך את יעילות הטרנספקציה, התחילו עם דגימות הייחוס שלא עברו שוק. כדי למדוד את פעילות הלוסיפראז, הכינו תמיסת תגובה טריָה של 0.2 millimolar Luciferin בבופר Gly Gly המכילה 1 millimolar ATP ו-0.2 micromolar Coenzyme S reaction buffer. הכניסו את פלטת 96 הבארים ללומינומטר והפעילו את התוכנית.

תחנת עבודה Wallach 1420. הכנס את משאבה 1 אל תוך ה-Falcon tube המכיל 0.2 µM של ezine reaction buffer. בחר מהתפריט את האפשרות dispenser maintenance, וסמן את pump one.

בחר באפשרות fill כדי לערוך את פריסת הפלטה. בחר באפשרות, חקר את הפרוטוקול והתוצאות בתפריט. בחר את הפרוטוקול.

כעת בחרו את הבארים לקריאה. חזרו למנהל ה-Wallach ולחצו על start כדי למדוד את פליטות המדגם. ב-482 nanometers, עברו לתחזוקת המנפש (dispenser maintenance), בחרו ב-empty and pump one כדי לשחרר את כל התמיסה השארית בחזרה לשפופרת.

כעת העבירו את המבחנה לפלקון המכיל מים ובצעו שטיפה (flush). המשיכו על ידי בחירה באפשרות empty. לאחר מכן, הניחו את המבחנה ממשאבה אחת בתוך תמיסת התגובה (reaction buffer) ואת המבחנה ממשאבה שתיים בתוך תמיסת ה-LUCIFERIAN.

שנה את פריסת הפלטה. בחר באפשרות מילוי (fill) עבור משאבה אחת ומשאבה שתיים. מתפריט תחזוקת המנפנף (dispenser), בחר את הפרוטוקול והתחל במדידת תגובת ה-firefly luciferase באורך גל של 560 nanometers.

בסיום החזרות, חזור על הפרוצדורה: ריקון, שטיפה, ריקון. עבור משאבה אחת ומשאבה שתיים, צפה בתוצאות ב-Wallach 1420 Explorer. כל ניסוי מקושר לבדיקה (assay).

הזינו שם משתמש ותאריכי התחלה וסיום, וייצאו את התוצאות כקובץ Excel. לצורך הניתוח, קיפול חלבונים מחדש קשור ישירות לזמן ההתאוששות. בניסוי זה, התאים נבדקים בנקודות זמן שונות לאחר הלם תרמי.

בהיעדרו ובנוכחותו של צ'פרון מולקולרי. כפי שניתן היה לצפות, אחוז הלוסיפראז שעבר קיפול מחדש עולה עם זמן התאוששות ממושך הן בביקורות והן בתאים שעברו טרנספקציה של הצ'פרון המולקולרי. לעומת זאת, מערך נתונים לא תקין מציג ערכי R squared נמוכים עבור המתאם בין הזמן לקיפול מחדש.

בעקבות טכניקה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקת TPAs in vitro, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון עיכוב של הפעילות האנזימטית של השפרונית (chaperone). לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן מדידת חלבון תוך-תאי בעקבות הלם תרמי.