יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ'יק
17 בנובמבר 2016
מתוארים פרוטוקולים המשתמשים במחסומים אטומים לחסימת אירועי אינדוקציה בין רקמות ציר הגוף הראשי והצד בעובר הגוזל הנדרשים להיווצרות גפיים. חרוזים ספוגים באותות אינדוקטיביים מועמדים משמשים להתגברות על ההשפעה של מיקום מחסום וניתוח ביטוי גנים מאשר זאת.
מטרת התערבות כירורגית זו היא להבהיר את מנגנוני השראת הגפיים בעובר הגוזל על ידי מניעת פיזור מולקולות איתות מרקמות מדיאליות לתאים במזודרם הצלחת הצדדית וחקר השפעתו על ביטוי גנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית כגון, מהם האותות האינדוקטיביים לשליטה בהתחלת ניצני הגפיים. היתרון בטכניקה זו הוא שעובר הגוזל נגיש למניפולציה כירורגית וחזק מאוד, בנוסף, ניצן הגפה הבקרה הנגדית הלא מנותח משמש כבקרה פנימית שימושית מאוד.
סוזן ויילד תדגים את הנוהל. כדי להתחיל, חותכים חתיכה מרובעת בגודל 1 ס"מ של נייר אלומיניום בעובי 0.013 מ"מ ומעקרים אותה על ידי ניגובה באתנול 70%. לאחר מכן, הניחו את הריבוע על צלחת פטרי מפלסטיק סטרילית בגודל 6 ס"מ.
כדי למנוע היצמדות סטטית, השליכו את המכסה והכינו חדש למנה מאותו נייר כסף. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי על גבי גרטיקול במה תחת מיקרוסקופ דו-עיני המוגדר בהגדלה של פי 1.6. השתמש באזמל קטן להב מספר 15 כדי לחתוך רצועות ברוחב 1.3 מ"מ של נייר הכסף באורך 2 מ"מ.
הפרד את רצועות נייר הכסף באמצעות שני זוגות מלקחיים של יצרני שעונים מספר ארבע. לאחר מכן, בצע כיפוף בזווית ישרה במרכז מחסום נייר הכסף כך שהוא דומה לציר. יישרו את המחסומים במרכז צלחת הפטרי כשצד אחד שטוח כנגד הצלחת והשני מצביע החוצה מהצלחת, הכינו 20 מחסומים או יותר לפני יום הפעולה.
הניחו את מכסה נייר הכסף מעל הכלי ואחסנו את המחסומים במקום בו הם לא יופרעו. כשהביצה שוכבת על צדה, אחזו בחוזקה בזוג מלקחיים חזקים מסוג AA והשתמשו בתנועת דקירה מבוקרת כדי לנקב את הקצה הקהה של הביצה המכילה את שק האוויר תוך החזקת הביצה ביד החופשית. וודא שקרום המעטפת הפנימי נשבר.
לאחר מכן, קחו את הביצה בשתי הידיים וסובבו אותה 180 מעלות לאורך הציר האופקי שלה. לאחר מכן, קחו חתיכת סרט שקוף, כ -5 ס"מ רבוע והדביקו אותה היטב על פני השטח העליונים של הביצה כדי למנוע מקליפת הביצה להתפורר על העובר בעת פתיחת הביצה. השתמש במספריים מעוקלים כדי לפרוץ בעדינות את הקליפה ואת קרומי התאים הפנימיים הקשורים אליה במרכז החלק העליון של הביצה.
צרו חור קטן מאוד עם להב אחד של המספריים כדי שאוויר יוכל להיכנס לביצית מעל העובר. השתמש במספריים כדי להגדיל את החור בקליפה לעיגול בקוטר של כ -1 ס"מ. מוציאים את חתיכת הקליפה הזו בגודל ביצה מהביצה.
מכסים את החור על הביצה בחתיכת סרט שקוף בגודל של כ -5 ס"מ מרובע. לחץ על הסרט כדי להדביק אותו רק בשפת החור והשאיר את הסרט שנותר חופשי. לאחר מכן ניתן לתפוס את הסרט החופשי כדי לפתוח את הביצית בקלות.
קחו עובר שלב 15 מהאינקובטור והניחו את הביצה על משענת ביצה תחת מיקרוסקופ דו-עיני המכוון להגדלה של פי 3.2 ומעלה. לאחר מכן, הסר את השכבה העליונה של סרט שקוף. בעזרת סכין מיקרו מפלדה, בצע חתך דרך קרום הוויטלין והניח לרוחב מזודרם בסמוך לסומיטים 26-32 בצד ימין של העובר.
הרם את המחסום עם מיקרו מלקחיים מספר 5 בקצה אחד וסובב את המחסום כדי להכניס את הקצה החופשי לתוך החתך. בהקדם האפשרי, אטמו את הביצה בעזרת סרט שקוף והחזירו אותה לחממה. אם יש להכניס חרוז בשילוב עם מחסום, ראשית, הכינו חרוזים ספוגים בחומצה רטינואית כמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.
לאחר מכן, קח את החרוז וזוג מיקרו מלקחיים מספר 5 והכנס אותו לפנים החתוכות של המזודרם הצדדי בצד הדיסטלי של החתך. לאחר מכן, הכנס את המחסום לתוך החתך הפרוקסימלי לחרוז. אוטמים את הביצה ומחזירים אותה מיד לחממה.
אם יש להכניס חרוז או חרוזים ללא מחסום, אל תבצע את החתך הארוך. במקום זאת, בצע חתך קטן דרך קרום הוויטלין ולתוך המזודרם של הצלחת הצדדית במיקום שבו יש למקם את החרוז. לאחר מכן, קח את החרוז ומלקחיים מיקרו מספר 5 והכנס אותו לחור במזודרם הצלחת הרוחבית.
דחף אותו עוד קצת עם הקצוות הסגורים של המלקחיים. קח עובר שלב 10 עם חלון מהאינקובטור והנח את הביצה על משענת ביצה תחת מיקרוסקופ דו-עיני המוגדר להגדלה של פי 3.2 ומעלה אם אתה מעדיף. לאחר מכן, בעזרת סכין מיקרו מפלדה, בצע חתך דרך קרום הוויטלין והמזודרם של הצלחת הרוחבית, לרוחב הפס הפרימיטיבי בקצה הזנב של העובר בקו אחד עם הסומיטים, באורך של כשישה אורכי סומיטים.
לאחר מכן, הרם את המחסום עם זוג מלקחיים מיקרו מספר 5, בקצה בולט מצלחת הפטרי וסובב את היד כדי להכניס את הקצה החופשי של המחסום לתוך החתך. בהקדם האפשרי, אטמו את הביצה בעזרת סרט שקוף והחזירו אותה לחממה. אם יש להחדיר חרוז ללא מחסום, בצע חתך קטן דרך קרום הוויטלין ולתוך המזודרם של הצלחת הצדדית במיקום שבו יש למקם את החרוז.
לאחר מכן, קח את החרוז וזוג מיקרו מלקחיים מספר 5 והכניס אותו לחור במזודרם הצלחת הרוחבית. לבסוף, דחפו אותו פנימה עוד קצת עם הקצוות הסגורים של המלקחיים. מוצג כאן מיקום המחסום ברמת הרגל המשוערת של סומיטים 26-32 בעובר שלב 15.
מחסום זה מוביל לכך שביטוי Fhf10 ו-Fhf8 נעדר באזור ניצני הרגליים בצד המנותח וקיים בצד שמאל שאינו מנותח. עם זאת, ביטוי Tbx4 נצפה הן בשלב 19 והן בשלב 23 בצד המנותח. זה מרמז שביטוי Tbx4 לבדו אינו מספיק כדי ליזום צמיחה של הגפה האחורית מה-lpm.
כאשר חרוזים ספוגים בחומצה רטינואית ממוקמים רחוק למחסום בשלב 15, Tbx4, Fgf10 ו-Fgf8 מתבטאים כולם בצד המופעל מכיוון שהם בצד הבקרה השמאלי. לפיכך, בהתפתחות תקינה, חומצה רטינואית מהסומיטים חיונית לפני שניתן להתחיל צמיחת ניצני גפיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במחסומים אטומים ובחרוזים ספוגים מועמדים כדי לחקור כיצד אותות אינדוקטיביים מווסתים את התחלת ניצני הגפיים בעובר הגוזל.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר התערבות כירורגית לבחינת מנגנוני השראת גפיים בעוברים של אפלוף באמצעות חסימת דיפוזיה של מולקולות סיגנלינג. השמוש במחסומים בלתי חדירים ובסיגנלים השראתיים באמצעות חרוזיים מפורט במאמר, יחד עם ניתוח ביטוי גנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה
- העברה של אותות (Signal Transduction)
רקע
- הבנת תהליך התפתחות הגפיים היא קריטית בביולוגיה התפתחותית.
- עוברים של אפרוחים נגישים למניפולציה כירורגית.
- אותות השראה ממלאים תפקיד מרכזי בהיווצרות ראשונית של ניצן הגפה.
- ניתוח ביטוי גנים מסייע בהבהרת תהליכי התפתחות.
מטרת המחקר
- לבחון את תפקידם של מולקולות איתות בהשראת גפיים.
- להעריך את השפעתם של מחסומים על ביטוי גנים בעוברים של אפרוח.
- לזהות את אותות ההשראה הדרושים להיווצרות ניצן הגפה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מחסומי נייר אלומיניום לצורך התערבות כירורגית.
- החדרת חרו지를 ספוגים בחומצה רטינואית לבדיקת ביטוי גנים.
- ביצוע חתכים בממברנה הוויטלינית ובמזודרם של הפלטה הלטרלית.
- ניתוח ביטוי גנים של Tbx4, Fgf10 ו-Fgf8 בעוברים שעברו ניתוח.
תוצאות עיקריות
- מחסומים מונעים את הביטוי של Fgf10 ו-Fgf8 בניצן הגפה המנותח.
- ביטוי של Tbx4 קיים הן בצד המנותח והן בצד שאינו מנותח.
- חומצה רטינואית חיונית ליזום את צמיחת ניצן הגפה.
- השיטה מאפשרת מחקרים מבוקרים של התפתחות הגפיים.
מסקנות
- הטכניקה הכירורגית מבודדת ביעילות מסלולי איתות באינדוקציית הגפיים.
- תוצאות ביטוי הגנים מדגישות את חשיבותו של חומצה רטינואית.
- גישה זו מספקת תובנות לגבי מנגנוני התפתחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח של סיגנלינג השראתי בהתפתחות חולייתנים הוא קריטי לתיקוף מטרות ולצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישת מחסום הבלתי חדיר וחרוזי הגורם המועמד בעוברים של אפרוחים מאפשרת בידוד מדויק של מסלולי סיגנלינג, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בהקצאת המסלול. שיטה זו מסייעת בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו על ידי הבהרת התפקיד הסיבתי של אותות מועמדים בהשראת רקמות ובאורגנוגנזה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של מסלולי איתות מועמדים במודל חולייתים ניתן למניפולציה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מעורבות המסלול באינדוקציית רקמות ובאורגנוגנזה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד השפעותיהם של גורמים ספציפיים, כגון retinoic acid.
- מספק בקרות פנימיות באמצעות רקמה קונטרלטרלית שלא עברה ניתוח לצורך ניתוח השוואתי מהימן.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מבסס מערכות ביולוגיות מתוקפות לצורך ניתוח ביטוי גנים בשלבים הבאים.
- מאפשר מניפולציה הדירה של סביבות איתות לצורך קבלת תוצאות כמותיות.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי בקרה של אספקת גורמים מועמדים במרחב ובזמן.
- מכין את המערכת להערכה מהימנה של מודולטורים או מעכבים של מסלולים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את בחינת נתיבי הפיתוח למודלים של השראת רקמות הרלוונטיים למחלה.
- מספק רצף מהשלב של גילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות איתות.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים באמצעות הבהרת הנחיצות והמספיקות של מסלולים בתהליך האורגנוגנזה.
- תומך בזיהוי ביומרקרים תרגומיים באמצעות תוצרי ביטוי גנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
שיטה זו משתלבת בשלב הגילוי המוקדם ותיקוף המטרה, ומגשרת בין בדיקת היפותזות לבין פיתוח מודלים פרה-קליניים עבור מסלולי השראה של רקמות.
- ביולוגיה של גילוי: מבודד ובחן את נחיצותם של אותות מועמדים באינדוקציית רקמות, ובכך תומך בבירור המסלול.
- סריקה: מספק מערכת הניתנת לשחזור לצורך ניתוח כמותי של ביטוי גנים בעקבות מניפולציה של המסלול.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה ישירה של שינויים בביטוי גנים (למשל, Tbx4, Fgf10, Fgf8) בתגובה להפרעה במסלול.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים של מסלולי התפתחות לאורגנוגנזה ולמודלים פוטנציאליים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לבחינת רמזים אינדוקטיביים מגוונים ברקמות שונות ובהקשרים התפתחותיים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהקצאת מסלולים ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק מניפולציה סטנדרטית, הדירה וניתנת להרחבה של סביבות איתות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הבהרת הדרישות המכניסטיות להשראת רקמה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם-סיכון של מטרות איתות לפיתוח נוסף.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה אמבריולוגית ובניתוח ביטוי גנים.
- נדרשת גישה לסטראו-מיקרוסקופיה, לכלי מיקרו-דיסקציה ולתשתית להיברידיזציה in situ.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים עבור מיקום המחסום והחדרת החרוצים.
- ניתן להתאמה לרקמות עובריות נגישות אחרות ולשלבי התפתחות שונים.
- מוגבל למערכות שבהן הפרדה מרחבית של רקמות היא ישימה וניתן למדוד ביטוי גנים באופן מהימן.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Create Barriers from Aluminum Foil
2:08
'Window' the Incubated Chicken Eggs
3:35
Barrier to Prevent Leg Bud Initiation and Bead Operations at Stage 15
5:20
Barrier to Prevent Leg Bud Induction and Initiation at Stage 10
6:34
Results: Retinoic Acid from the Somites Is Essential for Limb Bud Outgrowth
7:36
Conclusion
