ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים
12 בינואר 2022
בדיקת החרוזים הספוגים כוללת אספקה ממוקדת של ריאגנט הבדיקה בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לחקור את ויסות התמיינות התאים והמורפוגנזה. מוצג פרוטוקול מפורט, החל על כל מודל ניסיוני של בעלי חיים, להכנת שלושה סוגים שונים של חרוזים מושרים והשתלתם באינטרדיגיט של עובר עוף.
בדיקה זו מאפשרת לתלמיד להסתכל על מולקולות ספציפיות בתהליך התפתחותי רבים, כגון התמיינות תאים ומורפוגנזה על ידי השתלת החרוזים באזורי עובר מובחנים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל מודלים ניסיוניים של בעלי חיים, תרבית תאים, מודל אורגנוטיפי, כולל אורגנואידים. יתר על כן, זהו כלי חינוכי מועיל להוראת ביולוגיה התפתחותית בסיסית לתלמידים.
מי שתדגים את ההליך תהיה אלכסנדרה גונזלס-גונזלס, סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה. כדי להתחיל, לדגום את ביצי התרנגולת הלבנות המופריות של Leghorn בצורה אנכית עם הצד המחודד למטה באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 70%. ברגע שהם מגיעים לשלב 28, על פי המבורגר והמילטון, מוציאים את הביצים מהאינקובטור, מחליפים אותן ב-70% אתנול ומאפשרים להן להתייבש באוויר.
לאחר מכן יש לחטא את אזור העבודה, המיקרוסקופים והמכשירים עם 70% אתנול. לאחר מכן, נרות את הביצים כדי לזהות את כלי הדם ולאתר את העובר. השליכו ביציות שאין להן עובר.
באמצעות קצה של מלקחיים שאינם משוננים, פתח חלון על ידי הקשה על הקצה הקהה של ביצה, והסר קטע קליפה של סנטימטר מרובע אחד. לאחר מכן, העבירו את הביצה לקרטון או למחזיק פלסטיק והניחו אותה מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. באמצעות מלקחיים כירורגיים עדינים, הסר כל חתיכה קטנה של קליפת ביצה שיכולה ליצור קשר עם העובר ולהסיר את קרום האוויר על ידי ניקוב ומשיכתו החוצה.
לאחר מכן, באמצעות מלקחיים כירורגיים עדינים, לקרוע מעט את שק מי השפיר, נזהר שלא לפגוע בכלי הדם של קרום Chorioallantoic. שלב את העוברים בתוך אובו כדי לקבוע אם הם נמצאים בשלב הרצוי. להכנת חרוזי הפרין ג'ל אפי, חתכו חתכו חתך פרפילם בצורת ריבוע כדי שיתאים לצלחת פטרי בגודל 45 מ"מ.
לאחר הנחת הפרפילם על פני החלק התחתון של צלחת הפטרי, תוך שימוש בקצה המלקחיים שאינם משוננים, דחפו כל קודקוד וקבעו אותו לתחתית המנה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה או מרית, מעבירים את החרוזים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ושוטפים אותם פעמיים עם PBS על ידי מתן אפשרות להם להתיישב ולטפטף את הסופרנאטנט. לאחר מכן, באמצעות מיקרו פיפטה, להעביר 40 עד 50 חרוזים למרכז צלחת פטרי מכוסה parafilm מכוסה.
תחת מיקרוסקופ, בחר 30 חרוזי אפי-ג'ל או הפרין בעלי קוטר של 100 מיקרומטר. גודל החרוזים תוך שימוש באינטרדיגיט שלישי של עובר בן 28 שלבים כהפניה. החרוז חייב להיות קטן יותר מהאינטרדיגיט.
לאחר הסרה קפדנית של עודפי ה-PBS המקיפים את החרוזים שנבחרו, משרים אותם בשניים עד חמישה מיקרוליטרים של תמיסת הטיפול. דגירה של החרוזים בתמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, כדי למנוע מהחרוזים להתייבש, פיפטו כמה טיפות של PBS או מים סביב החרוזים כדי לח את האטמוספירה המקומית ולכסות את המנה בפרפילם כדי להאט את האידוי.
יוצקים הכנת חרוזים AG1X2. השתמש במרית כדי להעביר את החרוזים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ולהוסיף 50 מיקרוליטרים של תמיסת הטיפול בריכוז הסופי הרצוי. לאחר עטיפת הצינורות בנייר כסף כדי להגן עליהם מפני אור, דגירה של החרוזים במשך 20 דקות ברעידה איטית.
לאחר הדגירה, באמצעות פיפטה, יש להסיר כמה שיותר מתמיסת הטיפול בכתם עם 0.2% פנול אדום מומס במים במשך שתי דקות עם תסיסה קלה במערבולת. לאחר ההכתמה, הסר את הצבע, ולאחר מכן שטפו את החרוזים פעמיים ב- PBS כדי להסיר כל צבע שיורי. לאחר מכן, באמצעות קצה מיקרו פיפטה, העבירו 40 עד 50 חרוזי AG1X2 למרכז צלחת הפטרי המכוסה בפרפורם והשרו את החרוזים בחמישה מיקרוליטרים של PBS.
לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ, בחר כ -30 חרוזים בקוטר 100 מיקרומטר בגודל. הטביעו את החרוזים שנבחרו בתמיסת הניסוי בכמה טיפות של PBS או מים סביב החרוזים כדי לחדות את האטמוספרה המקומית. מכסים את המנה בפרפילם כדי להאט את ההתאדות.
לפני שתתמרנו את העוברים, מסדרים שני מיקרוסקופי סטריאו זה ליד זה על ספסל. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים ללא שיניים, צור חלון בביצים הנותרות. לאחר מכן, מתחת למיקרוסקופ לקרוע את קרום מי השפיר ליד הגפה האחורית הימנית עם מלקחיים כירורגיים עדינים.
באמצעות מלקחיים עדינים, החזק את העובר על ידי קרום מי השפיר כדי לחשוף את הגפה האחורית הימנית. לאחר מכן, באמצעות מחט טונגסטן עדינה, בצעו חור שמרכזו בדיסטלי ביותר של האינטרדיגיט השלישי של הגפה האחורית. מבלי לשחרר את העובר ואת האיבר האחורי החשוף, קחו חרוז מטופל אחד מהמיקרוסקופ השני באמצעות אחד מקצות המלקחיים.
המלקחיים חייבים להיות פתוחים כדי שחרוז אחד ייצמד לקצהו. מעבירים את החרוז לעובר האפרוח ליד הגפה האחורית, וממקמים אותו על גבי החור הבין-ממדי. להפעיל לחץ על החרוז על ידי סגירת המלקחיים עד שהוא נכנס לחור.
לאחר מכן שחררו את העובר, אטמו את חלון קליפת הביצה בנייר דבק והחזירו את הביצים לאינקובטור עד שהגיעו לשלב הנדרש. כדי להבטיח את יעילות הבדיקה, יש למקם את החרוז באופן עקבי ומדויק במיקום הנכון. במחקר זה, החרוז הספוג הונח בתוך הדיסטלי ביותר של האינטרדיגיט השלישי מתחת לרכס האקטודרמלי האפיקלי.
ניתן להכתים את העוברים בכחול אוקיינוס ובאדום אליעזרין כדי להצביע על היווצרותם של יסודות השלד ולהעריך את ההשפעות על התמיינות התאים. בדיקה זו מתאימה גם להערכת מוות תאי עם ויסות אדום וגנים נייטרלי, קניית הכלאה C2. היתרון העיקרי של כלי ניסיוני זה הוא לשלוט בזמן ובמיקום של החרוזים הספוגים.
שילוב מיקום הליבה לתזמון התפתחותי מדויק מספק אפשרויות עצומות לחקור תהליכי התמיינות תאית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
בדיקת חרוזי הספיגה (soaked bead assay) מאפשרת הובלה ממוקדת של ריאגנטים לבדיקה בשלבי התפתחות שונים, במטרה לחקור התמיינות תאים ומורפוגנזה. פרוטוקול זה ישים לכל מודל של בעלי חיים ניסייוניים, כולל עוברים של תרנגולות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- דיפרנציאציה של תאים
- אמבריולוגיה
רקע
- בדיקת חרוזי ההשייה (soaked bead assay) היא שיטה לחקר מולקולות ספציפיות המעורבות בתהליכי התפתחות.
- ניתן להחיל זאת על מודלים ניסויים שונים, כולל מודלים אורגנוטיפיים ואורגנואידים.
- שיטה זו משמשת ככלי פדגוגי להוראת מושגי יסוד בביולוגיה התפתחותית.
- הדגמת הפרוצדורה מבוצעת על ידי סטודנט לתואר ראשון.
מטרת המחקר
- לבחון את הבקרה עלהתמיינות תאים ומורפוגנזה.
- לספק פרוטוקול מפורט להכנה ולהשתלה של חרוזי ספיגה.
- לשפר את החוויות הלימודיות בביולוגיה של ההתפתחות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגירה של ביצי תרנגולת מאובנות בסביבה מלחחת.
- הכנה של חרוזי ספיגה להשתלה.
- השתלה של חרוזים באזורים ספציפיים של העובר.
- תצפית על תהליכי התפתחות לאחר ההשתלה.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מדגימה בהצלחה את ההשפעות של ריאגנטים לבדיקה עלהתמיינות תאים.
- היא מספקת תובנות לגבי תהליכים מורפוגנטיים בעוברים.
- הפרוטוקול ניתן להתאמה למודלים שונים של בעלי חיים.
- סטודנטים רוכשים ניסיון מעשי בטכניקות של ביולוגיה התפתחותית.
מסקנות
- בדיקת חרוזי ההשייה היא כלי רב-גוני לחקר ביולוגיה התפתחותית.
- היא מסייעת להבנת תהליכים ביולוגיים מורכבים.
- ניתן להשתמש בשיטה זו ביעילות במסגרות חינוכיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת חרוזי ההשריה מאפשרת הובלה מרחבית וזמנית מדויקת של מורפוגנים או מולקולות מועמדות במודלים עובריים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים. באמצעות בקרת המיקרו-סביבה המקומית, שיטה זו מספקת תובנות יישומיות לגבי החלטות גורל תאי, מורפוגנזה ותבניתיות, ומזינה באופן ישיר את הביטחון החזוי בנקודות התפנית המרכזיות של תהליך הגילוי. יכולת ההסתגלות שלה במערכות מודלים השונות משפרת את הרציפות התרגומית בכל רחבי הפורטפוליו ותומכת בבדיקת השערות חסונה עבור מטרות התפתחותיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולים המונעים על ידי מורפוגנים ושל קביעת גורל התא בהקשר מבוקר in vivo.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות מועמדות על ידי בידוד ההשפעות של מולקולות ספציפיות על דפוס הרקמה.
- מקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על תוצאות התפתחותיות בעקבות הפרעה מקומית.
- מספק פלטפורמה לבדיקה מונחית-השערה של תפקוד גן או חלבון בהתפתחות עוברית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות עובריות מתוקפות לסריקה המשכית של תרכובות ביו-אקטיביות או ביולוגיים.
- מאפשר הערכה כמותית הדירה של שינויים פנוטיפיים בתגובה להגשה מולקולרית מקומית.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות מיקום מדויק של חרוזים וקביעת שלב התפתחותי.
- מאפשר התאמה ניתנת להרחבה (scalable) לאורגניזמי מודל אחרים או למערכות אורגנוטיפיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים פנוטיפים התפתחותיים למסלולים רלוונטיים למחלה לצורך חקירת ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רציפות ממחקרי מנגנונים בשלב הגילוי ועד לתיקוף במודלים פרה-קליניים.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון על ידי הבהרת ההשפעה התפקודית של מולקולות מועמדות עלהיווצרות רקמות.
- תומך בהפחתת סיכונים חזויה עבור תוכניות של רפואה התפתחותית ורפואה רגנרטיבית.
שילוב תהליכי עבודה ו-Pipeline
בדיקה זו משתלבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לבין זיהוי מובילים (lead identification), ובכך היא מגשרת בין תיקוף מטרות מונחה-השערה לבין סריקה פנוטיפית במודלים עובריים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות להגשה מקומית ותצפית על השפעות של מורפוגנים.
- סריקה: מספקת תוצרי פנוטיפ כמותיים וניתנים לשחזור להערכת תרכובות או חלבונים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של התמיינות תאים, תבניתיות ותוצאות מורפוגנטיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים התפתחותיים למערכות מודל פרה-קליניות ולזיהוי פוטנציאלי של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת להסתגלות ולשימוש חוזר למחקרים התפתחותיים ומכניסטיים מגוונים לאורך הפורטפוליו.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של יעדים התפתחותיים.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובעלות יכולת הרחבה עבור בדיקות התפתחותיות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות בנוגע להמשך התקדמות (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרת הסיכון הביולוגי בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד בעדיפויות מותאמות סיכון וקידום של תוכניות התפתחותיות וregenerative.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באמבריולוגיה, ביולוגיה התפתחותית ומניפולציה מיקרו-כירורגית מדויקת.
- דורש גישה למיקרוסקופים סטריאוסקופיים, אינקובטורים מבוקרים ותשתיות להכנת חרוזים (beads).
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים למיקום החרוזים, שלבי ההתפתחות והערכה פנוטיפית.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של בעלי חיים ומערכות אורגנוטיפיות באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות כוללות שונות טכנית במיקום החרוזים והצורך בתזמון התפתחותי מדויק.
