ניטור מרחבי הפרדה Surface מיישבים אוכלוסיות מיקרוביאליות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בהתפלגות מרחבית של זנים מיקרוביאליים במהלך נחיל, החלקה או היווצרות ביופילם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה החברתית, כגון כיצד הפרדה מרחבית משפיעה על אינטראקציה מיקרוביאלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להעריך בקלות את הכושר וההתפלגות המרחבית של זנים מיקרוביאליים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיות וניתוח תמונות תת-מקטעים.

תדגים את ההליך תרזה הולשר, חוקרת דוקטורט מהמעבדה שלי. ביום שלפני הניסוי, הוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום LB לצינור תרבית וחסנו אותו ממלאי מקפיא של B.subtilis. חזור על חיסון זה עם שפופרת נפרדת לכל זן מעניין.

הכניסו את הצינורות לאינקובטור טלטול אופקי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להכנת צלחות לניסויי נחילים והחלקה, שפכו 20 מיליליטר מדיום LB מחוסם לצלחת פטרי פוליסטירן בגודל 90 מילימטר. סוגרים את המנה מיד והם מניחים אותה בצד אחד של מכסה המנוע הסטרילי להתקרר לפחות שעה.

לאחר מכן, הכינו צלחות לניסויי ביופילם של מושבות על ידי יציקת 25 מיליליטר אגר פעמיים SG בינוני לתוך צלחת פטרי של 90 מילימטר. סוגרים מיד את הצלחות ומניחים אותן להתקרר בערימות של ארבע או פחות למשך שעה לפחות. כדי להתחיל, הנח את צלחות הנחיל וההזזה של LB agar במכסה זרימה למינרי והסר את המכסים.

הניחו לצלחות להתייבש במשך 20 דקות. הלחות של הלוחות בניסויים אלה היא קריטית. בעוד שעודף לחות מאפשר לחיידקים לשחות, ייבוש ממושך מונע נחיל והחלקה.

באופן דומה, מבנה הביופילם של המושבה תלוי ביובש של המדיום. באמצעות ספקטרופוטומטר, קבע את הצפיפות האופטית של תרביות התחלה לילה ב-600 ננומטר. בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, צפיפות התערובת מנורמלת כמויות של החלבון הפלואורסצנטי הירוק והאדום המייצרים זנים בסך הכל 200 מיקרוליטר.

מערבל את הצינור למשך שלוש שניות. בעזרת מיקרו-פיפטה, הבחין בשני מיקרוליטרים של התרבית המעורבת על מרכז צלחת אגר LB מיובשת מראש של 90 מילימטר במכסה הזרימה הלמינרית. מניחים את הצלחת לייבוש למשך 10 דקות.

לבסוף, דגרו את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס במצב זקוף כדי למנוע הצטברות עיבוי על פני האגר. ראשית, הניחו את צלחות האגר SG פעמיים במכסה זרימה למינרי למשך 15 דקות לייבוש. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר כל אחד מזן החלבון הפלואורסצנטי הירוק והאדום המייצר ביופילם, תרביות התחלה B.subtilis 168, לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

מערבל את הצינור למשך שלוש שניות. הכן צינורות עם 100 מיקרוליטר מדיום LB ובעזרת התרבות המעורבת, צור סדרת דילול פי 10 של חיסונים. בעזרת מיקרו-פיפטה, הבחין בשני מיקרוליטרים של התרבות המעורבת הלא מדוללת על צלחת אגר SG כפולה.

חזור על זה עם חיסונים עבור 10 לאחד, 10 לשניים, 10 לשלוש ו-10 לארבע הדילוליות, ריווח נקודות במרחקים שווים כדי לאפשר גידול של שש עד תשע מושבות על צלחת אחת. דגרו את הצלחות זקופות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יום עד שלושה ימים. כדי להתחיל, הניחו צלחות על פלטפורמת ההדמיה של מיקרוסקופ שמזהה פלואורסצנטיות.

עבור ניסויי החלקה ונחילים, הגדר את מקור החיסון, אמצע צלחת הפטרי, לפינת השדה הנראה כדי לאפשר מדידה של התרחבות מושבה רדיאלית. כוונן את ההגדלה לרזולוציה הגבוהה ביותר המאפשרת הדמיה של האזור הגדול ביותר האפשרי של לוח ה-90 מילימטר. התאם את זמן החשיפה בהתאם, בהתאם לעוצמת האות הפלואורסצנטי.

לניתוח ביופילם, מקם מושבת עניין במרכז שדה הראייה. הגדר את ההגדלה ברזולוציה הגבוהה ביותר המאפשרת צפייה במושבה כולה. מושבות מוכנות כעת למדידה וניתוח.

לבסוף, נתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. איור זה מראה את הצמיחה של מושבת Bacillus subtilis טיפוסית המחוסנת במשותף עם שני זנים. נחיל, שהוא תנועה קולקטיבית תלויה בשוט, מביא לאוכלוסייה מעורבת מאוד.

בסרטון זמן-lapse זה, החיסון הראשוני הונח במרכז התפשטות הצלחת. נחיל שכבה דקה נצפה בבירור וככל שהמושבה מתפתחת, שני הזנים הפלואורסצנטיים האדומים והירוקים נראים מעורבים וחופפים. לעומת זאת, תמונות של התנהגות החלקה מראות מגזרי גדילה מוגדרים המתאימים לזנים הפלואורסצנטיים המסומנים באופן שונה.

סרטון זה מראה את צמיחתה של מושבה מחוסנת במשותף שבה הזנים חסרים דגלים מתפקדים. מושבות אלו עדיין מסוגלות להתפשט באמצעות שילוב של אקסו-פוליסכריד מופרש, הידרופובין וסורפקטין. המושבות המתקבלות מציגות מבחר צמיחה מרחבי מובהק בהשוואה לזן הנחיל.

מושבות המייצרות ביופילם החלו בצפיפות תאים השפיעו מאוד על המבחר המרחבי של המושבות שנוצרו. מושבות שהחלו עם צפיפות תאים גבוהה של האוכלוסיות המעורבות, הראו מבחר מרחבי מינורי או ללא מישור. לעומת זאת, כאשר צפיפות התאים בהתחלה הייתה נמוכה ניתן היה לזהות מגזרים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים ברורים.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את השפע היחסי של זנים המסומנים פלואורסצנטית במושבות מיקרוביאליות, לבחון הפרדה מרחבית ולחקור את השפעת צפיפות התאים המייסדים.