אפיון Microbiome Dynamics – Cytometry זרימה מבוסס זרימות עבודה מתרבויות טהור לקהילות טבעי

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באקולוגיה מיקרוביאלית ובביוטכנולוגיה, למשל, אילו מושגים אקולוגיים מניעים כל מערכת אקולוגית נתונה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לסגור את הדינמיקה המהירה של המיקרוביום עם משטר הדגימה הקצר תוך שמירה על חסכוני ביותר. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבל מידע על קהילות מיקרוביאליות ביוטכנולוגיות וטבעיות וגם על מיקרוביום של בעלי חיים ובני אדם למצבים תזונתיים ובריאותיים.

מי שידגים את ההליך יהיה פלוריאן שטנברג, טכנאי ומפעיל SediMeter במעבדה שלנו. כדי לייבש דגימת קהילת ביוגז, השתמש בקצה פיפטה של מיליליטר אחד שונה כדי להעביר 200 מיקרוליטר מהעיכול הצמיג לצינור של שני מיליליטר המכיל 1.7 מיליליטר PBS. לאחר ערבוב יסודי, הנח את הצינורות באמבט קולי למשך דקה אחת כדי לפרק את כל אגרגטים של תאים גדולים ולחבר תאים שנדבקים לשאריות תאי הצמח.

לאחר הסוניקציה, מערבבים היטב את הדגימה ומסננים את התאים דרך מסננת רשת נקבוביות של 50 מיקרומטר לתוך צינור פלסטיק של 2 מיליליטר. חלקו את המסנן לארבעה אליקוטים של 400 מיקרוליטר וצנטריפוגו את האליקוטים פעמיים, והשליכו את הסופרנטנט לחלוטין בשתי הפעמים כדי להשקות את דגימת המיקרואורגניזם באופן מכני בצורה יסודית ככל האפשר. לאחר מכן יבש את הדגימה בצנטריפוגת ואקום מחוממת ליצירת כדור יציב ואחסן את הגלולה בארבע מעלות צלזיוס מוגנת מפני אור.

לייצוב וקיבוע של דגימות בוצה מופעלות, יש לצנטריפוגה ארבעה מיליליטר מהתאים ולהשעות מחדש את הגלולה בארבעה מיליליטר של שני אחוז פורמלדהיד ב-PBS. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה את דגימת התא המיוצבת וקבעו את הגלולה בארבעה מיליליטר של 70% אתנול לאחסון מינוס 20 מעלות צלזיוס. מערבבים ומעבירים 0.6 מיליליטר ממתלה התא הקבוע לצינור זכוכית המכיל 1.4 מיליליטר PBS ולאחר ערבוב יסודי, סוניקט למשך 10 דקות כפי שהודגם.

בתום הסוניקציה, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה, והשעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר PBS טרי. לאחר ערבוב יסודי, סוניקציה של התאים כפי שהודגם זה עתה למשך חמש דקות והתאם את ה-OD 700 ננומטר ל-035 עם PBS טרי. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר פרמביבליזציה המכיל 0.11 חומצת לימון מולארית, ו-4.1 מילי-מולר טווין 20, עם ערבוב יסודי, למשך 20 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן אספו את התאים על ידי צנטריפוגה, ותלו מחדש את הגלולה ביסודיות בשני מיליליטר של תמיסת צביעה המכילה 0.68 מיקרו-מולרי DAPI, למשך 60 דקות לפחות דגירה בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור. לכיול חרוזים, טען את תערובת החרוזים לכיול ליניארי לתוך ציטומטר הזרימה, ומדוד את החרוזים ברציפות תוך מניפולציה של מיקומי הזרבובית ואופטיקת הלייזר כדי לכייל מראש את המכשיר בטווח הליניארי. כאשר ניתן להתאים את פסגות החרוזים לתבנית כיול מוגדרת מראש, עבור למצב יומן וטען דגימת חרוז כיול לוגריתמית.

התאם את פסגות החרוזים הלוגריתמיות לתבנית הכיול המוגדרת מראש שלהן כדי לכוונן את החומרה של המכשיר, והשתמש בהגדרת הרווח של צינור מכפיל הפוטו כדי לבצע את כל ההתאמות הסופיות הדרושות למיקום החרוז ההיבט הקריטי ביותר של הליך זה הוא שמירה על מדידות עקביות כדי לאפשר השוואה בין ניסויים. לכן, כיול ציטומטר יומי ושימוש בחרוזים בעפעפי הגזע הביולוגיים חיוניים להצלחת דיאליזה איטית של מיקרוביום ציטרומי. כאשר התאים מוכנים, מערבבים ומסננים את הדגימות ומוסיפים את תערובת החרוזים הלוגריתמית לתאים.

כעת מערבבים וטוענים את הדגימה על הציטומטר ויוצרים שער שיכלול את התאים המוכתמים ולא יכלול את הרעש והחרוזים. לאחר מכן נתח את קבוצת הדגימה ברציפות במהירות מקסימלית של 3,000 אירועים בשנייה עד שמתגלים 250,000 תאים בתוך שער התא. כדי לנתח את נתוני ציטומטריית הזרימה, פתח תבנית שער אב לשימוש בכל הדגימות.

התחל בטעינת הקבצים הסטנדרטיים של ציטומטריית הזרימה לתוכנית ניתוח ציטומטריית זרימה מתאימה ועבד את הדגימות ברצף. טען את הדגימות, לחץ פעמיים על מדידה ובחר את פרמטרי ציר X ו-Y, מהתפריטים הנפתחים המתאימים להם כדי לפתוח פיזור קדימה לעומת עלילת פלואורסצנטיות DAPI. השתמש בכלי ציור המצולע כדי לשחזר את שער תא המדידה שנוצר בעבר כדי לא לכלול את החרוזים והרעש, ולתת שם לשער בהתאם.

גרור את ערך שער התא לרשימה כל הדוגמאות ולחץ פעמיים על שער התא כדי להציג באופן סלקטיבי רק את אירועי התא. הגדירו את תת-הקהילות הנפוצות במדגם בעזרת כלי השער האליפטי, ואגד אותן. לאחר מכן הוסף הקצאות תת-קהילה נוספות ודוגמאות עוקבות עד שתבנית שער האב תתאים לכל הדגימות.

שלוט בתבנית השער הראשי באמצעות שיטת סריקת פיזור הצד כדי לפתור תת-קהילות המתקבצות קרוב זו לזו. לאחר מכן, הוסף את כל תת-הקהילות לעורך הטבלאות, והגדר את סטטיסטיקת הפלט לתדירות האב. השתמש בעורך הטבלאות כדי לייצא את השפע היחסי של תת-הקהילה לתוכנת גיליון אלקטרוני מתאימה, והתאם את עיצוב הנתונים בהתאם להנחיות במדריך סרגל הצד.

לאחר מכן, כדי להמחיש את הדינמיקה והמתאמים של תת-הקהילה, התקן וטען את חבילת R, וטען ונרמל את קובץ ה-txt. פיזור קדימה לעומת עלילות פלואורסצנטיות DAPI חושפות את מצבי מחזור התא של תרביות זן טהור בנקודות שונות בתרבית אצווה. שימוש בתבנית שער מאסטר מאפשר לכמת את שיעור התאים עם כרומוזום אחד, שניים או מרובים, וחושף, למשל, את יכולתו של חיידק מייצג זה לשכפל את הכרומוזומים שלו מהר יותר מזמן הדור שלו.

כאשר חוקרים קהילות מיקרוביאליות מורכבות לאורך זמן, ניתן לדמיין בקלות את הקצב והמשמעות של שינוי הקהילה באמצעות רצף עלילת נקודות. ניתן לזהות בבירור את תת-הקהילות הדומיננטיות בשלבים שונים של הניסוי באמצעות כלי הברקוד הציטומטרי. שילוב נתונים אלה עם התפלגות התדירות של השפע היחסי של תת-הקהילה מאפשר בחירת שערים המדגימים שינויים משמעותיים בשפע בנקודות זמן מרכזיות.

הדמיה של נתונים אלה בתרשים קנה מידה רב-ממדי לא מטרי יכולה להקל על הבנה מעמיקה יותר של הדינמיקה הקהילתית. קהילות ביוגז עלולות להתמודד עם הטרוגניות מרחבית עקב מגבלות תסיסה. נקודות הדגימה של קהילת הגז הביולוגי המופתית מציגות הטרוגניות מרחבית מועטה, אך בולטת.

מתאמים חיוביים או שליליים חזקים עם פרמטרים אביוטיים כמו מהדקי מוצרים, יכולים לעזור בהבנה ואופטימיזציה של מערכות אקולוגיות ותהליכים ביוטכנולוגיים. יתר על כן, הם מקלים על זיהוי שערים בעלי עניין מיוחד למיון וניתוח לאחר מכן. בעת קביעת נוהל זה, מומלץ להעריך נהלי קיבוע וצביעה שונים כדי להעריך את ביצועיהם ויציבותם עבור כל סט דגימות חדש.

לאחר המיון, ניתן ליישם גישות נוספות כגון גידור אמפליקוני, מטגנומיקה ופרוטאומיקה כדי לבחור את הקהילות המובילות המספקות מידע על השתייכות גנטית פרוטו במצבי פעילות מחוץ למסלולים מטבוליים. שיטה זו סללה את הדרך לאקולוגים מיקרוביאליים ומהנדסי תהליכים ביולוגיים לעקוב אחר הדינמיקה של המיקרוביום, מערכות אקולוגיות טבעיות ומבוקרות בהשקעה סבירה של משאבים.