אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

באידרמיס. אימונוהיסטוכימיה היא אמצעי יעיל לאיתור חלבונים ספציפיים במדור הביטוי שלהם. בסרטון זה, אנו מדגימים שיטה מהימנה למיקום אימונולוגי של חלבון באידרמיס, שבה אנו משתמשים באופן שגרתי במעבדה שלנו.

שלום, אני טמי מהמעבדה של ד"ר Turin כאן במבנה הנמוך של מכון המחקר לבריאות באוטווה (Ottawa Health Research Institute) בתוכנית למחלות כרוניות. היום נדגים לכם פרוצדורה של אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים על חיתוכי רקמה של אפידרמיס של עכבר המשומרים בפרפין. במעבדה שלנו, ביצענו אופטימיזציה לפרוטוקולים של מיקום אימונולוגי של סמני התמיינות אפידרמלית באמצעות רקמות מקובעות ב-BO'S.

כחלק מאופטימיזציה, אנו שומרים על העור שטוח על ידי פריסתו על נייר סופג לפני הקיבוע. הליך זה כולל דיסקציה של האפידרמיס, קיבוע, דהידרטציה, טמיעה בפרפין, וחיתוך דגימות, לאחר מכן הסרת שעווה, רהידרטציה, חשיפת אנטיגן (antigen unmasking), סימון בנוגדנים, ולבסוף הרכבה והדמיה באמצעות פלואורסצנציה אפיפוסלית (epi-fluorescence). אז בואו נתחיל.

בשימוש בעכברים ניאונטליים, אין צורך לגגל את עור הגב. עם זאת, כאשר משתמשים בעכברים מבוגרים יותר בעלי פרווה, יש לגגל את עור הגב כדי שהפרווה לא תפריע לחיתוך הנגדים. במהלך הניתוח, יש להיזהר מאוד שלא להחדיר את הפינצטה לאזורי העור המיועדים לבדיקה.

לכן, כל שעלינו לעשות הוא להניח את הפינצטה מסביב לקצה האזור שבו נגזור, ולאחר מכן להרים בזהירות רבה ולגזור את האפידרמיס, תוך זכירה לא לגעת באזור שבו נרצה להשתמש עבור הניסוי. כאשר אנו מקבעים את העור, איננו רוצים שהעור יתגלגל ויהיה בתוך המבחנה. אנו רוצים שהוא יהיה מתוח ושטוח.

כדי לסייע בכך, אנו מניחים את העור על נייר סופג כך שיישאר שטוח במהלך הקיבוע. כעת, לאחר שהעור מונח בצורה שטוחה על נייר הסופג, אנו גוזרים את הקצוות או מקצצים אותם כדי להסיר את החלקים שייתכן שנפגעו עקב השימוש בפינצטה. לאחר מכן, גוזרים את העור לחתיכות קטנות מאוד, בגודל של כ-2 millimeter על 2 millimeter.

כעת תבוצע קיבוע של הרקמה. לאחר חיתוך העור לחתיכות שניתן לעבוד איתן, טבלו אותו בתמיסת ה-boin. סגרו את המבחנות במכסה, עטפו את המבחנות ב-perfil והניחו אותן על רוקר (rocker).

עבור דגירה למשך לילה, חשוב לדגור בתמיסת ה-boin למשך 16 עד 18 שעות בלבד. תקופות קיבוע קצרות או ארוכות יותר יפגעו ברקמה. הדגירה הסתיימה.

שטוף את הרקמה ב-PBS ולאחר מכן בסדרה של שטיפות אתנול תוך שימוש באלכוהול בריכוזים של 30%, 50% ו-70%. ניתן לראות כי ה-BO הוא בצבע צהוב, ובמהלך השטיפות, ככל שה-boons מדולל, צבע השטיפה הופך לפחות ופחות צהוב. שטוף פעמיים, למשך 30 דקות בכל פעם.

לאחר השטיפה האחרונה באתנול, הדגימות מוכנסות לאתנול 70% טרי וניתן לאחסנן בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד נוסף של הסרת פאראפין. הטמעה. בשימוש ברקמות קפואות, שלמות הרקמה היא טובה יותר וניתן לאחסן את הדגימות לפרקי זמן ממושכים. באופן כללי, מתקני ליבה (core facilities) מפיקים תוצאות הניתנות לשחזור במידה רבה יותר.

עם זאת, אם ברשותכם המתקנים הדרושים ומפעיל ייעודי בעל מומחיות, ניתן לחתוך את הנגיפים במעבדה. למידה של חיתוך נגיפים איכותי היא כמעט סוג של אמנות; לכן, אנו נעזרים במרכז שירותי ליבה.

לאחר קבלת הנסכים חזרה מהמעבדה המרכזית, ניתן לראות כי הפרפין נמצא על הנסכים. כשהם בשכבה דקה, מניחים את הנסכים על מתקן העטוף בנייר אלומיניום, בדומה לתפוח אדמה אפוי, ומדגירים למשך חמש דקות ב-55 degrees. לאחר סיום הדגירה, מסירים במהירות את העטיפה ומניחים את הנסכים בטולואן לשלושה שלבי שטיפה של חמש דקות כל אחד.

חשוב מאוד לזכור כי יש לתזמן במדויק את השטיפות הללו שנמשכות חמש דקות; אינקובציה ממושכת מדי בטולואן תפגע בדגימות. לאחר שלושת השטיפות והטולואן, בצעו שטיפה מהירה באתנול 100%. מכיוון שאתנול וטולואן יוצרים משקב שעלול להפריע לניסוי, זהו שלב חשוב מאוד לזכור.

בשלב הבא, הדגימות עוברות רהידרטציה על ידי אינקובציה של השקופיות למשך חמש דקות ב-95% ethanol, חמש דקות ב-70% ethanol, ולאחר מכן פעמיים למשך חמש דקות במים. בנקודה זו, ניתן להעביר את הרקמות לתהליך צביעה ב-h and e. אנו משתמשים במעבדה המרכזית (core facility) לצורך זה.

לחשיפת אנטיגנים, שפכו 500 mils של תמיסת באפר ציטראט (citrate buffer) לכלי כימי מפלסטיק בנפח של ליטר אחד והטבילו בו את השקופיות. זכרו להסיר את הידית המתכתית ולהכניס את הכלי למיקרוגל. חממו במיקרוגל בהספק גבוה למשך פעמיים חמש דקות.

זכרו לפתוח את הדלת כדי לצנן את המיקרוגל בין שתי תקופות האינקובציה. לאחר סיום החימום במיקרוגל, הוציאו את השקופיות מתוך תמינת הציטראט הרותחת והניחו אותן בכלי צביעה המכיל מים חמים. אנו משתמשים פשוט במי ברז חמים, ומטרת שלב זה היא לצנן את השקופיות באיטיות מטמפרטורת רתיחה לטמפרטורת החדר.

כעת ניתן לשטוף את הנסקיות שלוש פעמים למשך חמש דקות ב-PBS, ואנו מוכנים להתחיל בתהליך האימונוהיסטוכימיה. הפעולה הראשונה שעלינו לבצע כדי להתחיל בצביעה האימונולוגית היא לייבש את האזור שסביב הדגימות באמצעות נייר סופג. כדי למנוע זיהום צולב של נוגדנים, אנו מסמנים את האזור שסביב הדגימות באמצעות חסם נוזלי (liquid blocker).

הכינו תא לחות על ידי הנחת נייר סינון בתוך צלחת פטרי. השרו אותו במים, הסירו את עודפי המים והכניסו את העגיות. הסיבה לשימוש בתא לחות היא כדי להבטיח שהעגיות לא יתייבשו במהלך תקופות האינקובציה.

חשוב מאוד שהשקופיות לא יתייבשו, כיוון שייבוש יעלה את הרקע. בשלב זה חוסמים את השקופיות עם באפר אינקובציה למשך 30 דקות. לאחר החסימה, העבירו את השקופיות בחזרה למעמד השקופיות והדגירו אותן בבאפר שטיפה.

הסר את עודפי הבאפר בדיוק כפי שעשית קודם לכן. החזר את הזכוכית אל תא הלחות והדגר עם נוגדן ראשוני למשך שעה אחת, בטמפרטורת החדר.

עם סיום דגירה של שעה אחת, החזירו את השקופיות למסגרת השקופיות ושטפו עם בופר שטיפה שלוש פעמים למשך 10 דקות. לאחר השטיפות, הסירו את עודפי בופר השטיפה מסביב לדגימה באמצעות נייר סופג. החזירו את השקופיות לתא הלחות והדגירו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נוגדן משני. לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני, שטפו בשלוש החלפות של בופר שטיפה למשך 15 דקות בכל פעם.

בשלב הבא, נבצע שטיפה של שלוש פעמים למשך חמש דקות. ב-PBS, נסיר כל שאריות נוזלים מסביב לדגימה וננגב את ה-PBS מגב השקופית כדי להצמיד את זכוכית הכיסוי לשקופית. אנו משתמשים ב-mobile עם 2.5%DAB co.

על מנת להפחית דהייה, יש להוסיף 80 µL בטפטוף על השקופיות, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות אוויר. לאחר מכן, יש להוריד באיטיות רבה זכוכית כיסוי.

הקפידו לא להשאיר בועות אוויר. בועות הן בעייתיות כיוון שהן נוטות להנח במיקום המדויק של הדגימה, בדיוק במקום שבו תרצו לצלם לאחר שהמובייל יתייבש. כעת אתם מוכנים; בחנו את הפסליות שלכם.

להלן תצפית על צביעה מוצלחת באמצעות מסנן FITC. בעזרת עדשה אובייקטיבית של 20x, ניתן לראות את Claudin six מקושר לכל השכבות הסופר-בזאליות של האפידרמיס. המעבדה שלנו מעוניינת מאוד בביטוי ובמיקום של claudins באפידרמיס.

בנוגע לצמתים הדוקים ולהיווצרות מחסום החדירות האפידרמלי, הראינו לכם כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה על עור עכבר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שעל נתיכי הרקמה להיות שטוחים ושעליכם לוודא שהזכוכיות לא יתייבשו בין שלבי האינקובציה. זהו כל ההליך.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.