פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם
14 ביוני 2017
הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ ביעילות חלבונים מהמסתם המיטרלי של הלב האנושי, המתאימים לניתוח פרוטאומי. שיטה זו יכולה לסייע בחשיפת מנגנונים פתוגניים בתחום מחלות מסתמי הלב, ולאפשר זיהוי של סמני מחלה אבחנתיים ופרוגנוסטיים חדשים ובתקווה, של מטרות טיפוליות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא בכך שהוא מספק זרימת עבודה יעילה של חילוץ התואמת ליישומים אנליטיים רבים.
התוצאה היא אפיון ממצה יותר של פרוטאום המסתם המיטרלי הלבבי. יתר על כן, ניתן ליישם פרוטוקול זה גם על מערכות אחרות, כגון המסתם המיטרלי החזירי, הדומה מאוד למסתם האנושי ומשמש במודל ניסיוני להערכת תפקוד המסתמים. תדגים את הליך הניסוי סטפניה גילרדי, טכנאית מהמעבדה שלי.
כדי להכין את המסתם המיטרלי האנושי, התחל עם לב מושתל שהיה תחת איסכמיה קרה במשך ארבע עד 12 שעות. בחדר נקי, הוציאו את הלב מתיק ההובלה והכניסו אותו לדלי מעוקר. לאחר מכן, העבירו את הלב לארון בטיחות ביולוגית.
שם, בעזרת אזמל חד פעמי, חותכים בניצב לציר הראשי בגובה החדר השמאלי והימני, כארבעה סנטימטרים מהקודקוד. לאחר מכן הניחו את הלב על וילון סטרילי. לאחר מכן, הזיזו הצידה את אבי העורקים העולה ועורק הריאה כדי לגשת לגג הפרוזדורים השמאלי.
בגג הפרוזדורים השמאלי, השתמש במלקחיים ובמכושים כדי לחתוך סביב האפרכסת השמאלית כדי לחשוף את המסתם המיטרלי. המסתם המיטרלי כלול במלואו בחדר השמאלי. לפיכך, חשפו את העלון המיטרלי הגדול ואת העלון המיטרלי הקטן.
הקומיסורים האנטרולטרליים והאחוריים מגדירים את גבול האזור הקדמי והאחורי. כעת, בעזרת מספריים ומלקחיים לא טראומטיים, נתחו את הפרוזדור השמאלי ואת עובי דופן החדר המקיף את המסתם המיטרלי. במהלך דיסקציה זו, זהה את המשכיות המסתם אבי העורקים המיטרלי.
לאחר מכן, הפרד את עלון המסתם המיטרלי הקדמי מעלון המסתם המיטרלי האחורי על ידי חיתוך לאורך הקומיסורים התוחמים את העלון האחורי. בסיום ההליך, יש לחטא את שולחן הארון בתמיסת אלכוהול איזופרופיל 70% ותמיסת מי חמצן 6%. כעת, שטפו את העלון האחורי של המסתם המיטרלי במי מלח.
לאחר מכן, חותכים את השסתום לחתיכות קטנות, כל אחת פחות מסנטימטר מרובע. עוטפים את החלקים בנפרד בנייר אלומיניום, ומקפיאים אותם בחנקן נוזלי. כדי להתחיל במיצוי החלבון, השתמש במלקחיים כדי להסיר דגימה מהחנקן הנוזלי, והניח אותה מיד על קרח יבש.
אל תתנו לדגימה להפשיר. לאחר מכן, לתוך בקבוק דיואר מלא בחנקן נוזלי, הניחו את המרגמה, העלים הנלווים והדגימה. זה קריטי שהחנקן הנוזלי ישמש להקפאת הדגימה ולקירור מערכת המטחנה.
שלב זה מונע פירוק ביולוגי ומאפשר אבקה יעילה, אך דורש הכשרה טכנית לטיפול בטוח. לאחר הקפאת הבזק, הכניסו את המרגמה והעליים לקופסת פוליסטירן המכילה קרח יבש. כמו כן, הניחו מרית על הקרח היבש.
לאחר מכן, הסר את הדגימה מהנייר כסף וטען אותה למרגמה. ומקם את העלי הגדול יותר מעליו. בעזרת מברג לסיבוב העלי, טוחנים את הדגימה 15 עד 20 פעמים.
תוך כדי הטחינה מערבבים את הדגימה עם קצה מרית צוננת. לאחר השימוש בעלי הגדול, חזור על תהליך הטחינה עם עלי קטן יותר. קבלת אבקה דקה חיונית למיצוי חלבון יעיל.
כעת, השליכו את הדגימה האבקה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מילילטר בעל מסה ידועה. לאחר מכן מברישים את כל החומר שנותר לתוך המרגמה בעזרת מרית קרה. שמור את הצינור עם הדגימה על קרח יבש וקבע במהירות את מסת הדגימה.
לאחר מכן, זרוק את הדגימה לתוך צינור הומוגנייזר זכוכית. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר אוריאה לכל 10 מיליגרם דגימה. בכך, שחזר את השאריות שנותרו בצינור על ידי שטיפתם עם מאגר האוריאה.
כעת הומוגניזציה של הדגימה באמצעות עלי PFTE ממונע הפועל במהירות של 1,500 סל"ד. לחץ לאט את העלי על הדגימה בתנועת פיתול 10 פעמים. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט הצהוב הצמיג לצינור צנטריפוגה נקי של 1.7 מיליליטר באמצעות פיפטה מזכוכית.
כעת חזור על ההומוגניזציה על הדגימה הנותרת תוך שימוש במחצית מכמות האוריאה. שחזרו את הסופרנטנט ושלבו אותו עם הקולקציה הקודמת. לאחר מכן, הנח את הצינור על מסובב צינור למשך 30 דקות.
לאחר 30 דקות, טען את הצינור לצנטריפוגה קרה וסובב את הדגימה ב -13, 000 גרם למשך חצי שעה. לאחר מכן, החזירו את הסופרנטנט. ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת החלבון של ברדפורד.
לאחר ביצוע הפרוטוקול שנקבע, תמצית החלבון נחקרה במגוון שיטות לאחר מספר טיפולים נוספים. בסך הכל זוהו 422 חלבונים ברקמת המסתם המיטרלי על ידי אלקטרופורזה דו מימדית, מיקוד איזואלקטרי בשלב נוזלי, כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה וכרומטוגרפיה נוזלית דו-ממדית-ספקטרומטריית מסה. 422 החלבונים סווגו באמצעות ניתוח אונטולוגיה גנטית.
האזורים החוץ-תאיים הכילו מספר חלבונים צפויים וחלבונים תוך-תאיים אחרים ועל פני התא. רבים מהם זוהו לראשונה במסתמים מיטרליים. נוכחותם של ארבעה חלבונים כאלה שלא זוהו בעבר במסתמים המיטרליים אושרה עם נוגדנים בשלוש דגימות ייחודיות.
החלבונים הם Septin-11, ארבעה וחצי תחומי LIM חלבון אחד, דרמטופונין ואלפא גבישי B.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ חלבונים מהמסתם המיטרלי הלבבי לצורך זיהויים וכימותם. לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך כמעט שעתיים אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, כדי לקבל את התשואה הגדולה ביותר של חלבונים עם שלמות חלבון גבוהה, חיוני שהדגימות לא יפשירו במהלך ההעברה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה נועד להפיק חלבונים בצורה יעילה ממסתם מיטראלי של לב אנושי לצורך אנליזה פרוטאומית. הוא עשוי לסייע בזיהוי סממנים אבחנתיים ופרוגנוסטים חדשים במחלות של מסתמי הלב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של הלב
- פרוטאומיקה
- מחלה של מסתמי הלב
רקע
- הרכב החלבונים של המסתם המיטרלי האנושי אינו מובן באופן מלא.
- צפיפות תאית נמוכה מקשה על ניתוח החלבונים.
- הבנת הפרוטאום של המסתם המיטרלי היא קריטית לבריאות הלב.
- ניתן להחיל פרוטוקול זה גם על המסתם המיטרלי של חזיר.
מטרת המחקר
- מתן שיטה יעילה להפקת חלבונים ממסמיא המיטרלי.
- הקלה על ניתוח פרוטאומי להבנה טובה יותר של מחלות שסתומי הלב.
- זיהוי יעדים טיפוליים פוטנציאליים וסמנים למחלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטוקול להפקת חלבון ממסרק לב אנושי.
- מתאים למגוון יישומים אנליטיים.
- הדגמה על ידי טכנאי מעבדה.
- יישום פוטנציאלי במודלים ניסויים.
תוצאות עיקריות
- הקמה של זרימת עבודה יעילה להפקה.
- אפיון מקיף יותר של הפרוטאומה של המסתם המיטרלי.
- פרוטוקול שניתן להחלה על מערכות דומות אחרות.
- תובנות לגבי מנגנונים פתוגניים של מחלות מסתמים.
מסקנות
- פרוטוקול זה משפר את ההבנה של הביולוגיה של המסתם המיטרלי.
- הוא עשוי להוביל לגילוי נתיבים אבחנתיים וטיפוליים חדשים.
- מחקרים נוספים יכולים להתבסס על עבודה יסודית זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה נותן מענה לצוואר בקבוק מרכזי בתהליך התיקוף של מטרות קרדיווסקולריות, על ידי הפיכת חילוץ חלבונים יעיל מרקמות בעלות דחיסות תאית נמוכה ועשירות במטריקס, כגון המסתם המיטרלי האנושי, לאפשרי. על ידי תמיכה באפיון פרוטאומי מקיף, הוא מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות טיפוליות במחלות מסתמי הלב. השיטה מגבירה את הביטחון החזיוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור פנוטיפים מולקולריים למנגנונים פתוגניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי חלבונים גלובלי ברקמות רלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה סטנדרטית להוצאת חלבונים מדגימות מאתגרות העשירות במטריקס חוץ-תאי.
- ערך ניבוי: תומך בגילוי סמנים ביולוגיים ובתעדוף מטרות על ידי חשיפת חלבונים חדשים הקשורים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר תמריתי חלבון התואמים ליישומים עוקבים כגון immunoblotting ומספקטרומטריית מסות.
- שחזוריות: מקריב תהליך מיצוי עקבי, החיוני לסטנדרטיזציה של הבדיקה בין מעבדות שונות.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר יישום על מערכות מודל, כגון מסתם מיטרלי של חזיר, לצורך תיקוף יעדים בין מינים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת נתונים של ביטוי חלבונים עם ניתוחים של mRNA ואימונוהיסטוכימיה לצורך תיקוף רב-אומיקה (multi-omics).
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מזהה חלבונים תוך-תאיים וחוץ-תאיים שלא זוהו בעבר במסתמי מיטראל, ובכך מבהירה את מנגנוני המחלה.
- רלוונטיות פרה-קלינית: מאפשרת תיקוף של מטרות במודלים הדומים באופן הדוק לפיזיולוגיה של מסתמי לב אנושיים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות אספקת קריאות מולקולריות מהימנות מרקמה חולה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות אפיון פרוטאומי מקיף של המסתם המיטרלי.
- סריקה: מספק תוצרי חלבון כמותיים המתאימים למסעות סריקה המכוונים לפתולוגיה של מסתמים.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח השוואתי של פרופילי ביטוי חלבונים בין תנאים שונים באמצעות בדיקת Bradford ואלקטרופורזה.
- מחקר תרגומי: מקל על קורלציה של נתונים פרוטאומיים עם ממצאי mRNA ו ממצאי אימונוהיסטוכימיה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להכנה פרוטאומית עבור תוכניות של מטרות קרדיו-וסקולריות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי חשיפת חלבונים שלא זוהו בעבר ברקמת מסתם המיטרלי.
- ערך תפעולי: מבטיח את שלמות הדגימה באמצעות טיפול בשרשרת קירור ומונע פירוק במהלך ההפקה.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון הביולוגי בבחירת המטרה על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי נתיבי מחלת המסתם.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות פרופיל מולקולרי מקיף של רקמת המחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות וטיפול בדגימות קרות למניעת הפשרה.
- נחושה גישה לציוד קריוגני (חנקן נוזלי, קרח יבש) וכלי הומוגניזציה ממונעים.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים בין הצוותים כדי להבטיח תנובות חלבון הניתנות לשחזור.
- יש להתחשב בשונות של הרקמות בעת ההתאמה לדגמי מסתמים שונים או למצבים מחלתיים שונים.
- מוגבל על ידי זמינות חומר המוצא; תלוי בגישה למסתמי אדם או חזיר שהוצאו בניתוח.
