MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

המטרה הכוללת של לכידת האינטראקטום (interactome) המעובדת של mRNA זו היא לבודד ולזהות פרוטאום הקשור ל-mRNA מתאי צמחים. שיטה זו יושמה על פרוטופלסטים של מזופיל מעלי *Arabidopsis thaliana*, סוג תאים המשמש ככלי רב-תכליתי במגוון בדיקות תאיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הבקרה הגנטית הפוסט-טרנסקריפציונית, כגון גילוי והבנת תפקידם של חלבונים קושרי RNA בשליח בצמחים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לבודד ולזהות שליח צמחי בתוך פרוטאום קשור ישירות מהסביבה הפיזיולוגית. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חלבונים הקשורים ל-mRNA מפרוטופלסטים של מזופיל מעלה של Arabidopsis. ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון פרוטופלסטים או רקמות של צמחים אחרים.

הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר הבחנו כי היא יושמה בהצלחה בשמרים ובקווי תאי יונקים. בודדו פרוטופלסטים ממזופילי עלי של arabidopsis עבור שתי דגימות שונות, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. שמרו את דגימת הביקורת שלא תעבור קישור צולב ב-UV, או דגימת ה-non-CL, על קרח.

העבירו את תרחיף הפרוטופלסטים המיועד לקשירה צולבת, או את דגימת ה-CL, לצלחת פטרי גדולה. הוסיפו לצלחת 30 milliliters של תמיסת MMG קרה (מקררי קרח) כדי לכסות את הפנימיות, ופזרו את התאים באמצעות פיפטור עדין. כסו את צלחת הפטרי בנייר אלומיניום בעת ההעברה למכשיר הקשירה הצולבת ב-UV.

הנח את צלחת הפטרי הפתוחה במכשיר לקשירה צולבת ב-UV באופן מיידי. וודא שהמרחק בין הצלחת לנורת ה-UV הוא שמונה סנטימטרים, ולאחר מכן הקרן את הדגימה למשך דקה אחת. לאחר מכן, העבר במהירות מנות מהסספנסיות של הפרוטופלסטים מצלחת הפטרי לשתי מבחנות חדשות בעלות תחתית עגולה בנפח 50 מיליליטר.

שטפו את תחתית הצלחת עם חמישה מיליליטרים נוספים של תמיסת MMG קרה במיוחד כדי לאסוף את שארית הפרוטופלסטים. חלקו את התמיה בין שתי המבחנות. לאחר מכן, סובבו במרכז פוגה (centrifuge) את מבחנת הדגימה שאינה CL ושתי מבחנות הדגימה של CL ב-100 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך חמש דקות.

לאחר השלכת הנוזל העליון, החזירו את המבחנה עם המשקע שאינו CL לקירור על קרח. הוסיפו 10 milliliters של תמיסת MMG קרה לכל מבחנה של דגימת CL ונערה בעדינות את המבחנות כדי להחזיר את המשקעים לתליה. לאחר איחוד שתי הדגימות למבחנה אחת בעלת תחתית עגולה בנפח 50 milliliter, סבבו בצנטריפוגה ב-100 times g בטמפרטורה של ארבע degrees celsius למשך חמש דקות.

לאחר השלכת הנוזל העליון, שמרו את המשקע על קרח. לאחר מכן, הוסיפו תשעה מיליליטרים של בופר קישור לליזיס קר לכל משקע תאים של הדגימות. בצעו ליזיס לפרוטופלסטים על ידי פיפוט מעלה ומטה כעשרים פעמים, עד שהתמיסה תהיה בצבע ירוק בהיר הומוגני.

עבור הומוגניזציה, העבירו את הליזט של הפרוטופלסטים פעמיים דרך מזרק זכוכית של 50 milliliter עם מחט צרה, ולאחר מכן הדגירו את הליזט על קרח למשך עשר דקות. הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי ואחסנו במינוס 80 degrees celsius למשך עד שלושה שבועות. לאחר הפשרת המבחנה עם הליזט הקפוא של הפרוטופלסטים בטמפרטורת החדר, שמרו את המבחנה על קרח.

העבירו מנה של 1.8 milliliters של חרוזי מגנט oligo-d(T) לשש פרוטות מיקרו-צנטריפוגה חדשות עם תחתית עגולה בנפח שני מיליליטר המונחות על קרח. שטפו את תגלי הירוצים בכל פרוטה באמצעות 600 microliters של lysis binding buffer על ידי פיפטור קצר למעלה ולמטה, וסובבו את החרוזים בעדינות על רוטטור למשך שתי דקות. השאירו את החרוזים על קרח.

בשלב הבא, העבירו את כל שש המבחנות המכילות את החרוזים למסרק מגנטי למשך שלוש דקות לפחות, כדי לאפשר זמן מספיק ללכידה מגנטית מלאה. כאשר החרוזים נלכדים לחלוטין, התמיה תהפוך לצלילה. לאחר מכן, השליכו את העל-מיסל מכל שש המבחנות והעבירו אליהן מיד מנות של תשעה מיליליטר של ליזט פרוטופלסטים.

ערבב את החרוזיים עם הלייזט באמצעות פיפוט עד שהתמיה נראית חומה והומוגנית. דגור את המבחנות בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת בסיבוב עדין. לאחר הדגירה, החזר את המבחנות למגנט למשך שלוש דקות.

כאשר כל החרו지를 נלכדים בדופן המבחנות, אספו את הנוזל העליון המכיל את תמצית הפרוטופלסטים לשש מבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות בעלות תחתית עגולה בנפח 2 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 מיליליטר של wash buffer one קר מהקרח לכל מבחנה המכילה חרו지를, והשביו את החרו지를 למצב של סספנזיה באמצעות פיפטור. לאחר סיבוב עדין למשך דקה אחת, החזירו את המבחנות למעמד המגנטי למשך שלוש דקות.

שפכו את הנוזל העליון וחזרו על שלב שטיפה זה פעם אחת. בעזרת 1.5 milliliters של באפר שטיפה שני קר מאוד, חזרו על אותו הליך שטיפה פעמיים. אם ה-mRNP's בודדו ביעילות מליזאט הפרוטופלסט, צריכה להיות הילה נראית סביב משקע החרוגים בדגימת ה-CL.

לבסוף, חזרו על הליך השטיפה פעם אחת עם 1.5 milliliters של בופר מלח נמוך קרקיר. לאחר השטיפה, הוסיפו 500 microliters של בופר אלוציה לכל מבחנה, ושחזרו בעדינות את החרו지를 באמצעות פיפטינג. דגרו בטמפרטורה של 50 degrees celsius למשך שלוש דקות כדי לשחרר את ה-RNA בעלי זנב poly-A.

שחזר בעדינות את סספנסיון החריזים על ידי פיפטינג חד-פעמי והחזר את המבחנות למסרק המגנטי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. העבר ואחד את האלואנטים מכל שש המבחנות למבחנה בעלת תחתית קונית בנפח 15 מיליליטר המונחת על קרח. פעולה זו תניב כ-3 מילימטרים של האלואנט.

ניתן לקבוע באופן מיידי את האיכות והכמות של ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. הכינו את חרוזי ה-oligo-d(T) לשימוש חוזר על ידי שטיפתם פעמיים עם 1 ml של תמיסת אלות (elution buffer) קרה מאוד. לאחר מכן, שטפו אותם עם 1 ml של תמיסת קשירה לליזיס (lysis binding buffer) קרה מאוד כדי להחזיר את ריכוז המלח ל-500 millimolar.

השתמשו בחרוזי oligo-d(T) שוטפים אלו כדי לחזור על הליכי הקישור, השטיפה והאלוציה עבור שני סבבים נוספים. פעולה זו תדלל את ה-RNA בעל זנב poly-A מתוך הליזט של הפרוטופלסטים ותניב סה"כ תשעה מיליליטרים של אלואנט עבור כל דגימה. ניתן לאחסן את החרוזים ולהשתמש בהם לניסוי נוסף עד שלוש פעמים לכל היותר.

כדי לבדוק את איכות ה-RNA, יש לעכל את החלבונים שעברו קישור צולב ב-UV באמצעות תמיסת proteinase K בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, יש לטהר את ה-RNA באמצעות ערכה לטיהור RNA כדי להסיר מזהמים שנותרו. לאחר הטיהור, הדגימות מוכנות לבדיקת איכות ה-RNA באמצעות qRT-PCR.

התחילו בטיפול של שמונה מיליליטרים מכל דגימה עם 100 units של תערובת RNAse המכילה RNAse A ו-RNAse T1. לאחר ערבוב קצר ב-vortex, דגרו את הדגימות ב-37 °C למשך שעה אחת. כדי לרכז חלבונים קושרים של mRNA, או mRBPs, סננו את הדגימות באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות. כל דגימה תניב 75 µL עם שני µg של חלבון.

לאחסון לטווח ארוך, הקפיאו את הדגימות בטמפרטורה של 80- °C. להרצת ג'ל SDS-PAGE, ערבבו 25 µL מכל דגימה מרוכזת עם 15 µL של צבע טעינה (loading dye) בריכוז 2X וחממו את הדגימות בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. טענו את הדגימות יחד עם סמן חלבון (protein marker) על ג'ל SDS-PAGE בעל ג'ל ריכוז (stacking gel) של 5% וג'ל הפרדה (resolving gel) של 12%.

בשלב הבא, שטפו את הג'ל פעמיים במים אולטרה-טהורים למשך חמש דקות לכל שטיפה. השתמשו בערכה מסחרית לצביעה בכסף כדי לצבוע את הג'ל. אם נעשה שימוש במספר מספיק של פרוטופלסטים התחלתיים, פסי החלבון יופיעו בתוך חמש דקות.

כדי לבחון את ה-mRBP's באופן מעמיק יותר, טהרו את הפפטידים מג'ל 1D שני כפי שהוסבר בפרוטוקול הטקסט. פפטידים מטהרים אלו ניתנים כעת לניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית עם פאזה הפוכה בננו-קנה מידה (nano reverse-phased liquid chromatography), ספקטרומטריית מסות, ופרוטאומיקה איכותית וכמותית. לאחר לכידה באמצעות חרוזי oligo-d(T), הראה qRT-PCR רמות גבוהות באופן משמעותי של mRNA של poly ubiquitin 10 לעומת 18S rRNA.

מכיוון שחרוזי oligo-d(T) נקשרים רק ל-RNA בעל זנב poly-A, הדבר מעיד על כך שה-mRNA מועשר בתמיסת השטיפה (eluent). לכידת mRBP's באמצעות חרוזי oligo-d(T) מוערכת בהמשך באמצעות ג'ל SDS-page שנצבע בכסף. הג'ל מראה כמות חלבון גבוהה משמעותית בדגימת ה-CL שעברה קשירה צולבת ב-UV בהשוואה לדגימת ה-non-CL שלא עברה קשירה צולבת.

משך הקרינה ב-UV עשוי להשפיע על יעילות הצלוב (crosslinking). ג'ל SDS-page שנצבע בכסף מאשר כי קרינת UV למשך דקה אחת או שלוש דקות היא התנאי האופטימלי, עם עצימות הפסים החזקה ביותר. סך של 325 חלבונים זוהו באמצעות ניתוח פרוטאומיקה כמותית.

225 מחלבונים אלה היו מתחת לרמת המובהקות בשל שכיחות נמוכה של פפטידים עבור כל חלבון, לצד שונות גבוהה בעוצמות הפפטידים. עם זאת, מכיוון שכל אחד מהם זוהה איכותית רק בדגימות CL, כולם נחשבו לתוצאות חיוביות. 325 חלבונים אלו סווגו לאחר מכן לשלוש קטגוריות: חלבונים ריבוסומליים, RBPs עיקריים, ו-RBPs מועמדים.

לחלבונים המועמדים לתפקיד RBP חסרים דומיינים קשורי-RNA קונבנציונליים ורוב תפקידיהם טרם תוקפו, דבר המצביע על פונקציות חדשות אפשריות בוויסות RNA. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שבוע במידה ותבוצע כראוי. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מסלולי הוויסות המולקולרי בצמחים לחקור את הפרוטאומה הקשור ל-messenger RNA ברמה גנומית בתאים ורקמות של דו-פסיים וחד-פסיים.