הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

מטרת הליך זה היא לבודד ולזהות שורות תאים קלונאליות עם נוק-אאוט (knockout), שנוצרו באמצעות שני סוגים של עריכה גנומית המתווכת על ידי CRISPR/Cas9. שיטה אחת מזהה נוק-אאוט של חלבון הנגרם על ידי חיבור קצוות לא הומולוגי (nonhomologous end joining), בעוד שהשנייה מזהה שיבושים גנומיים שנוצרו על ידי תיקון מכוון הומולוגיה (homology-directed repair). שיטה זו שימושית במיוחד בתחום הביולוגיה המולקולרית, שבו יצירת שורות תאים עם שיבושים גנטיים היא כלי חשוב בניתוח תפקודי גנים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא שיטה מהירה ובעלת תפוקה גבוהה יחסית, שניתן לבצעה בקלות באמצעות טכניקות בסיסיות של ביולוגיה מולקולרית. חיבור קצוות שאינו הומולגי (Nonhomologous end joining) גורם למחיקות או להכנסות קטנות, ואלו מוערכות באמצעות dot immunoblot, בעוד שתיקון מכוון הומולוגיה (homology-directed repair) מאפשר הפרעות גדולות ומדויקות יותר, ואלו מוערכות באמצעות colony PCR. ניסוי זה משתמש בתאי T-REx-293 שגודלו במצע DMEM, בתוספת 10% FBS בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide.

לפני הטרנספקציה, זרעו את התאים בצלחות 6 בארות ושיירו בארה אחת עבור בקרת אי-טרנספקציה. גדלו את התאים עד להגעה למסף של כ-70% confluency. בצעו טרנספקציה לתאים עם 2.5 micrograms של פלסמיד כולל, תוך שימוש בפרוטוקול טרנספקציה מסחרי.

עבור טרנספקציה של תאים ללא סלקציה, השתמש ב-2.5 micrograms של פלסמיד Cas9-sgRNA. עבור טרנספקציה של תאים עם סלקציה, השתמש ב-0.75 micrograms של Cas9-sgRNA1, 0.75 micrograms של Cas9-sgRNA2, ו-one microgram של תבנית לרקומינציה הומולוגית. דגרי את התאים שעברו טרנספקציה ואת ביקרת התאים שלא עברו טרנספקציה ב-37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 48 שעות.

עבור תאים שעברו טרנספקציה לבחירה, התחילו את הברירה התרופתית על ידי טיפול בתאים בתרופה המתאימה, שבמקרה זה היא Neomycin. החזירו את פלטת שש הבארות לאינקובטור. עקבו אחר התאים המטופלים פעם ביום כדי לבדוק את שיעורי תמותת התאים, עד שכל התאים בביקרת הלא-טרנספקטיים ימותו.

כדי לבודד אוכלוסיות קלונאליות, ראשית גדלו את התאים עד להגעה ל-100% confluency בבאר המקורית לאחר הברירה. לאחר מכן, בצעו דילולים סדרתיים של התאים וספרו אותם. מכיוון שהיווצרות נכונה של מושבות מונוקלונאליות היא המפתח להשגת knockout מלא, יש להקפיד לקבוע את הדילול הנכון להזרעת תאים בצפיפות הרצויה.

לאחר שנקבעו הדילול הנכון, יש להעביר את התאים ללוחות בעלי 96 בארות בצפיפות של 0.33 תאים לבארה. העברת תאים לשלושה לוחות של 96 בארות היא נקודת התחלה טובה כדי להבטיח בידוד של יותר משבט נכון אחד. לאורך תקופה של שבועיים עד ארבעה שבועות, יש לעקוב אחר המושבות עד שיהיו גלויות לעין.

תמונות מייצגות אלו מראות מושבות בשלבי גדילה שונים: תא בודד בעת ההשבה, תאים ביום החמישי, ומושבה מבוססת ביום העשירי. בעזרת טיפ של פפית סטרילית, אספו בזהירות ובדיוק מושבות נראות לעין, והשביו אותן לבארות חדשות כדי לעודד גדילה בשכבה אחת (monolayer).

המשך לגדל את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. מועמדי knockout ללא סלקציה נסרקים באמצעות dot immunoblot כדי להעריך את תוצר החלבון באופן בעל תפוקה גבוהה. לאחר גידול של שיבוטים בודדים עד לרמת התמזגות (confluency) של 50 עד 100%, הפר את השכבה החד-שכלית (monolayer) של התאים על ידי פיפטור בתוך הבאר.

העבירו מנה של 90 µL מתוך נפח כולל של 100 µL מכל באר לשפרויר מיקרוצנטריפוגה נקי. לצורך סרטון זה, יעובדו שתי דגימות בלבד. סובבו בצנטריפוגה ב-6,000 RPM למשך חמש דקות, הסירו את המדיום, והליסו את משקע התאים ב-10 µL של 1X SDS loading buffer.

הוסיפו 90 µL של מצע גידול חדש לשארית התאים בבאר, והחזירו את הפלטה לאינקובטור כדי להמשיך את תרבית התאים. העבירו בעזרת פפט 1 µL של ליזאט תאים על גבי ממבנה ניטרוסלולוז יבש כדי ליצור נקודה. בצעו בלוט לכל דגימה פעמיים על שני ממבני ניטרוסלולוז נפרדים, כך שייווצרו שתי תבניות זהות של דגימות.

חסמו את הממברנות ב-5% חלב ב-TBST בטמפרטורת החדר, תחת נטילה, למשך שעה אחת. לאחר שעה, חשפו את הממברנות לנוגדנים ראשוניים בדילול המומלץ לנוגדן הראשוני, ב-TBST בתוספת 5% חלב. בממברנה אחת השתמשו בנוגדן ראשוני נגד חלבון המטרה, ELAVL1 בניסוי זה.

על הממברנה השנייה, השתמש בנוגדן ראשוני עבור חלבון בקרה שאינו צפוי להשתנות; כאן נעשה שימוש ב-PUM2. הדגרה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. הסר את תמיסת הנוגדן הראשוני מכל blot, הוסף TBST והדגרה למשך חמש דקות.

בדרך זו, שטפו את הבלוטים שלוש פעמים עם TBST. לאחר מכן, הוסיפו לכל ממבנה את הנוגדן המשני המתאים המשורשר ל-HRP, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר שעה אחת, שטפו את הממבנים שלוש פעמים עם TBST למשך חמש דקות בכל פעם.

יש להחיל תמיסת סובסטרט כימילומנסיאנטית על הבלוטים, בהתאם להוראות היצרן, ולהדמות את ממбраנות הבלוטינג במכשיר הדמיה כימילומנסיאנטית דיגיטלי. לבסוף, יש לכמת את עוצמת הנקודות עבור חלבוני המטרה והביקורת באמצעות התוכנה המתאימה, ולנתח את התוצאות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. מועמדים עם סמן עמידות נבחרים מסוננים באמצעות colony PCR.

התחילו את ההליך על ידי שכפול של מושבות בודדות בתוך פלטה חדשה בעלת 96 בארות, וגדלו אותן עד להגעה ל-100% confluency לצורך הכנת ליזאטים של תאים. הסירו את המדיום מקבוצה אחת של השיבוטים, השעיקו מחדש את התאים מכל בארה ב-30 µL של תמיסת מיצוי מערכה מסחרית להכנת DNA, והעבירו לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה נקייה בנפח 1.5 mL. חממו את התמיסה ל-96 °C במשך 15 דקות, ולאחר מכן תנו לה להתקרר לטמפרטורת החדר.

הוסיפו 30 µL של תמיסת ייצוב (stabilization buffer) לכל מבחנה למיקרוצנטריפוגה וערבבו היטב. כדי לזהות קווים מסוג פראי (wild-type) וקווים מוטנטיים מונו-אלליים או בי-אלליים באמצעות PCR של מושבות (colony PCR), תכננו שני סטים נפרדים של פריימרים ל-PCR להגברה של אזורים סביב זרועות ההומולוגיה, בהתבסס על הצלחה או כישלון של שילוב קסטת העמידות. בכל צד, השתמשו בפריימר משותף שנקשר מחוץ לזרוע ההומולוגיה.

כדי לבדוק את האלל מסוג הפרא (wild-type), השתמשו בפריימר המשותף יחד עם הפריימר הזוגי התואם, המשלים לרצף האנדוגני המשתרע על פני אזור ההומולוגיה. כדי לבדוק את המוטציה הרצויה, השתמשו בפריימר המשותף יחד עם פריימר זוגי אחר, המשלים לקסטת העמידות שהוחדרה. עבור כל דגימה לבדיקה, הכינו תערובת תגובה המכילה את הרכיבים הבאים: 0.5 µL של ליסאט תאים, 1.25 µL של 10X KOD buffer, 0.75 µL של 25 mM מגנזיום סולפט, 1.25 µL של 2 mM dNTPs, 0.375 µL של פריימר קדמי (forward primer), 0.375 µL של פריימר אחורי (reverse primer), 0.25 µL של KOD polymerase ו-7.75 µL של מים.

בצע PCR בתנאים הבאים: 95 °C למשך שתי דקות, ולאחריהם 25 מחזורים של 95 °C למשך 20 שניות, טמפרטורת ההמסה של הפריימר למשך 10 שניות, ו-70 °C למשך 20 שניות לכל KB. לאחר מכן, ויזואליזציה של תוצרי ה-PCR תבוצע באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. עריכה גנומית באמצעות חיבור קצוות לא הומולוגי (non-homologous end joining) בוצעה כדי ליצור קווי knockout של ELAVL1, ולאחריה dot immunoblot עם בדיקה (probing) ל-ELAVL1 ו-PUM2. קלונים שהפגינו אות בקרה חלש סומנו ב-X והוצאו מניתוחים נוספים.

שיבטים עם אותות ELAVL1 נמוכים נבדקו בהמשך באמצעות western blot. מועמדים מאושרים מסומנים בירוק, ומועמדים שנפסלו מסומנים באפור. גרפיקה זו מציגה את היחסים בין אות ה-ELAVL1 לאות של חלבון הבקרה בסדר עולה.

ברוב המקרים, אוכלוסיות קלונליות עם אות ה-ELAVL1 היחסי הנמוך ביותר זוהו נכונה כנוק-אאוטים (knockouts). מועמדים שנוצרו בשיטת תיקון מכוון על ידי הומולוגיה (homology directed repair) נסרקו באמצעות PCR של מושבות, ותוצרי ה-PCR הודגמו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. מוצגות כאן תוצאות לדוגמה תוך שימוש בפריימרים המכסים את נקודת החיבור של האינטגרציה במעלה הזרם, תוך שימוש בפריימרים פנימיים אנדוגניים ובפריימרים פנימיים של הנוק-אאוט.

ראשית, הפריימרים תוקפו הן בתאי ההורה והן בתאים שנבחרו באופן כולל (bulk selected cells). תוצאות מ-24 שיבוטים מועמדים בודדים מוצגות יחד עם תבניות הפסים הצפויות עבור שיבוטי טיפוס פראי (wild-type), נוק-אאוט (knockout), ומחיקה מונו-אללית.

קווי המוטנטים הבי-אלליים תוקפו בהמשך באמצעות western blot. חיבור קצוות לא הומולוגי (Nonhomologous end joining) משתמש בחיתוך Cas9 בודד ובסריקה שאינה תלויה בברירה, ולכן דורש מעט הכנה מוקדמת, וסריקה של שיבוטי knockout באמצעות dot blots יכולה לקבוע במהירות אם יצירת ה-knockout הצליחה. סריקה מבוססת PCR מזהה במדויק מועמדים נכונים בעלי הפרעות גנומיות גדולות שנוצרו על ידי תיקון מכוון להומולוגיה (homology-directed repair).

טכניקות אלו מאפשרות לחוקרים בביולוגיה מולקולרית לזהות נוק-אאוטים (knockouts) בקלות וביעילות, ובכך לאפשר להם לחקור תהליכים תאיים תקינים או לקויים באמצעות שורות תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד ולזהות שורות תאים של נוק-אאוט קלונלי שהופקו באמצעות עריכה גנומית מתווכת CRISPR/Cas9.