שיטה חישובית לכמת פעילות היממה לעוף
28 באוקטובר 2017
שיטה לכמת את התכונות העיקריות טמפורלית ראיתי במקצבים גינקולוגיות היממה לטוס מוצג. כימות מושגת על ידי התאמת הפעילות לטוס עם צורת גל מודל רב פרמטרית. הפרמטרים דגם מתארים את הצורה ואת הגודל של הבוקר ושל פסגות ערב של פעילות יומית.
ברוב בעלי החיים, שעונים ביולוגיים מתזמרים תהליכים התנהגותיים ומולקולריים ומסנכרנים אותם למחזור האור-חושך היומי. בזבובי פירות, השעון נחקר בדרך כלל באמצעות הקלטות תנועתיות. הנה דוגמה לתנועה ממוצעת של סוג פרא שנמדדת במחזור אור של 12 שעות, מחזור חושך של 12 שעות, מחזור האור-חושך מוצג עם פס צהוב-שחור למעלה.
תיעוד זבוב טיפוסי מראה דפוס ביומודאלי מורכב עם שני שיאים של פעילות, שיא בוקר המתרחש בסביבות עלות השחר ושיא ערב המתרחש בשעות בין ערביים. שתי הפסגות הללו יחד יוצרות צורת גל שונה מאוד מתנודות סינוסואידיות שנצפו בגנים של השעון, מה שמרמז על כך שלמנגנונים, בנוסף לשעון, יש השפעה עמוקה ביצירת הדפוס הנצפה בנתונים התנהגותיים. כאן אנו מציגים את השיטה הראשונה המתארת מתמטית טפיחות זמניות בפעילות זבובים.
אנו מתאימים את נתוני הפעילות לצורת גל מודל המחקה תנועת זבובים. המודל שלנו מורכב מארבעה מונחים מעריכיים, שני מונחים משיא הבוקר ושני מונחים משיא הערב. יחד עם המחזור הצירקדי, למודל שלנו יש תשעה פרמטרים בלתי תלויים.
פרמטרים B מגדירים את קצב עליית הבוקר, דעיכת הבוקר, עליית הערב ודעיכת הערב. TM ו-TE מגדירים את רוחבי הפסגות בבוקר ובערב, ו-HM ו-HE מגדירים את גבהי הפסגות. יחד פרמטרים אלה מתארים באופן מלא את הגודל והצורה של שיאי הבוקר והערב בדפוס הפעילות.
ניתן ליישם את השיטה שלנו כדי להבהיר את המנגנונים והמצע העומדים בבסיס דפוס הפעילות הבימודאלי הנפוץ בקריאות תנועתיות של זבובים. לניסוי התנועה, הכינו צינורות בודדים עם אוכל בקצה אחד וכותנה בקצה השני. לשם כך, ראשית, הכניסו חמישה עד שישה גרם מזון זבובים לכוס של 50 מיליליטר.
חותכים אוכל לחתיכות קטנות, כך שיהיה קל יותר להמיס אותו במיקרוגל. מוניטור פעילות יחיד מתאים ל-32 צינורות בודדים. לכן, קח 32 צינורות וחבר אותם יחד באמצעות גומיה.
ממיסים את האוכל בכוס במיקרוגל. מחממים את האוכל כ-10 עד 15 שניות. עצרו את המיקרוגל כל חמש שניות, ונערו מעט את הכוס עם האוכל כדי להבטיח המסה שווה של המזון.
וודאו שכל המזון נמס ולא נותרו חתיכות מזון מוצקות בכוס. בזמן שהאוכל עדיין נוזלי, הכניסו צינורות לכוס עם מזון. הזיזו את הצינורות למעלה ולמטה מעט, כך שהם יהיו מלאים באותה מידה.
תנו לאוכל להתקרר ולהתמצק כשעה. לאחר שהמזון מוצק, הסר את הצינורות מהכוס בתנועה סיבובית כדי שהמזון לא יידבק לתחתית הכוס. ואז הסר את הגומייה.
אוטמים את הקצה במזון בעזרת שעווה. לשם כך, ראשית, נגב בזהירות את הצינור בעזרת מגבת נייר. ואז לחץ את הצינור על השעווה.
בדוק חזותית את איכות החותם, ובמידת הצורך חזור שוב על האיטום. בעזרת טכניקה זו, אטום את כל הצינורות לניסוי. הקצה השני של הצינורות נסגר עם הכותנה.
הכותנה תאפשר לאוויר לעבור תוך שמירה על הזבובים נעולים בתוך הצינורות. קל גם להסיר ולהחזיר פנימה, מה שיהיה שימושי כאשר נעמיס את הצינורות עם הזבובים לניסוי. כעת, לאחר שהצינורות מוכנים, העמיסו אותם בזבובים לניסוי.
לשם כך, פרקו זבובים על המשטח עם CO2. לאחר מכן, בעזרת מברשת, הכניסו בזהירות זבוב בודד לכל צינור בודד. הכניסו את הצינור עם הזבוב לצג.
באותו סדר כמו בצג, תנועת זבוב תירשם בקובץ הפלט על ידי מערכת הצג. חבר את הצג למחשב, והנח אותו באינקובטור השומר על טמפרטורה ולחות קבועים. בהתבסס על הניסוי, הגדר את תנאי האור/חושך המתאימים.
עבור ניסוי אור/חושך, שמור זבובים במחזור אור-חושך במשך כל הניסוי. אל תשתמש ביום הראשון של המדידות בניתוח. לניסוי חושך מתמיד, ראשית, שמור זבובים במשך יומיים בתנאי אור/חושך לצורך אימון וסנכרון של השעונים, ולאחר מכן עבור לחושך קבוע.
אל תשתמש במדידות מהיום הראשון של חושך מתמיד בניתוח. לפני המעבר לסעיף הבא, מומלץ לקרוא את הפרוטוקול. מערכת המוניטור תפיק קובץ יחיד המכיל פעילות של כל הזבובים בצג.
32 העמודות האחרונות של קובץ הפלט מכילות פעילות של זבובים בודדים. התוכנית שלנו עובדת עם פעילויות זבוב בודד. לכן, פצל את קובץ הפלט למספר קבצי פעילות זבוב בודדים.
כל קובץ צריך להיות קובץ TXT בעל עמודה אחת. כעת, לאחר שנכין את קבצי הפעילות, נוכל להריץ את הניתוח שלנו. הפעל את הפונקציה ModelFitPS3 בחלון הפקודה של MATLAB עם פרמטרי הקלט הבאים.
קצב דגימה, שים מרווח זמן דגימת נתונים בשניות. לדוגמה, הנתונים שלנו נלקחו עם קצב דגימה של 20 שניות. לכן, שמנו כאן 20.
כמרווח סל, הגדר מרווח זמן בדקות, שאליו יאוחסנו נתונים לאחסנה לצורך תצוגה חזותית טובה יותר. אנו ממליצים ל-binning ל-20 או 30 דקות, אבל, לעת עתה, אשים כאן 10, רק כדי להראות לך מאוחר יותר כיצד ניתן לשנות את זה בקלות. עבור מגמה, שים אחד אם הנתונים הראו מגמת בסיס ואפס אחרת.
לנתונים שלנו אין שום מגמה בסיסית. לכן, שמתי כאן אפס. לחץ על Enter כדי להפעיל את הפונקציה.
בחלון המוקפץ, בחר קובץ פעילות זבוב בודד ולחץ על פתח. התוכנית תחשב ותשרטט את ספקטרום הספק הנתונים. בחלון זה, קבע את התקופה העיקרית בנתונים.
לשם כך, לחץ עם כפתור העכבר השמאלי בשיא בתקופה הצירקדית או עם כפתור העכבר הימני בשיא בהרמוניה שנייה, משוכפל בערך בתקופה הצירקדית חלקי שתיים. במקרה שלנו, שיא בהרמוניה שנייה הוא הרבה יותר גדול וחד מהשיא בתקופה הצירקדית. לכן אנו משתמשים באפשרות השנייה.
לאחר מכן, התוכנית תתווה נתונים מאוחסנים למרווח הסל שנבחר. כפי שאתה יכול לראות, במרווח סל של 10 דקות, שיא הבוקר והערב אינם נראים היטב. לכן, ברצוננו לשנות ערך זה.
כדי לעשות זאת, פשוט לחץ לחיצה ימנית במקום כלשהו בגרף. בתיבת הדו-שיח החדשה, הקלד את הערך החדש עבור מרווח הזמן בין הסלים. אנו ממליצים על binning למרווח זמן של 20 דקות.
לכן, שמנו כאן 20. לחץ על אישור. התוכנית משרטטת מחדש מיד את הנתונים עם הערך החדש של מרווח הסל. כדי לקבל ערך זה, פשוט לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי במקום כלשהו בגרף.
התוכנית כעת תשרטט מחדש את הנתונים ותציג רק חמישה ימי מדידה. בחלון זה, בחר את שיא הבוקר הראשון שישמש בניתוח. לפעמים יש צורך לדלג על יום או יומיים ראשונים, שלוקח לזבוב להסתגל למחזור האור-חושך.
כדי לבחור את שיא הבוקר, פשוט לחץ על הפסגה המועדפת. התוכנית תשרטט מחדש את הנתונים, וכעת תציג רק שלושה ימים של מדידות החל משיא הבוקר שנבחר. הקווים האנכיים הכחולים והאדומים מציגים את שיא הערב הראשון ואת שיא הבוקר השני בהתבסס על התקופה שנבחרה בחלון הראשון.
בחלון זה, בחר את הנקודה שבה הצינור שימש להתאמה ראשונית של הנתונים לפונקציית המודל. לשם כך, לחץ על הנקודות הבאות בסדר הספציפי הזה. ראשית, לחץ על החלק העליון של שיא הבוקר הראשון.
הקליק מסומן עם הכוכב האדום בתחתית, המציג את מיקום הלחיצה. לאחר מכן לחץ על סוף שיא הבוקר, ואז על תחילת שיא הערב, ואז על פסגת הערב, ואז בסוף שיא הערב, ולבסוף על פסגת הבוקר של היום שלמחרת. התוכנית תשרטט שוב את ספקטרום ההספק מכיוון שהפרמטרים הסופיים מתקבלים מהתאמה ספקטרלית.
הספקטרום משורטט כעת כתדר על ציר ה-x, והשיא הצירקדי ממוקם בצד שמאל של העלילה. התקופה שנקבעה בשלב הראשון מוצגת בקו אנכי אדום. כדי לבחור נקודות התאמה, ראשית, קבע בערך את התקופה העיקרית.
לשם כך, לחץ לחיצה ימנית על שיא בתקופה הצירקדית, או לחץ לחיצה ימנית על שיא בהרמוניה שנייה. נשתמש שוב באפשרות השנייה. לאחר מכן, יופיע מחוון בתחתית לבחירת הנקודות להתאמה הספקטרלית.
הנקודות יוצגו בעיגולים אדומים ויופיעו לאחר הזזת המחוון. הזיזו את המחוון שמאלה וימינה, ומקמו את הנקודות קרוב ככל האפשר לראשי הפסגות הספקטרליות. לאחר השגת התמונה הטובה ביותר, לחץ על כפתור קבל, והתוכנית תתאים את הנקודות שנבחרו עם הביטוי האנליטי עבור ספקטרום הספק הדגם.
לאחר ההתאמה, התוכנית תוציא שני גרפים נוספים. הראשון הוא ספקטרום הספק של המודל שנבנה עם הפרמטרים שחולצו. השני הוא נתונים המותאמים למודל.
הנתונים מוצגים בקו שחור, והמודל מוצג בקו אדום. ניתן לראות כי התפקוד דומה מאוד לנתונים, במיוחד בשלושת ימי הפעילות האחרונים. הפרמטרים שחולצו נשמרים בקובץ TXT של פרמטרי התאמת המודל.
לאחר שם הקובץ, הפרמטרים נשמרים בסדר הבא, תחילה b של דעיכת הבוקר, לאחר מכן b של זריחת הבוקר, b של עליית הערב, b של דעיכת הערב, התקופה הצירקדית, ואז רוחב שיא הבוקר חלקי התקופה הצירקדית, רוחב שיא הערב חלקי התקופה הצירקדית, גובה שיא הבוקר, גובה שיא הערב, וטעות ההתאמה של ההתאמה הספקטרלית. בנוסף לקובץ הפרמטרים של התאמת הדגם, התוכנית תוציא גם שני קבצים נוספים. הראשון, הוא התאמת הנתונים לפונקציית המודל, והשני הוא התאמה ספקטרלית.
בצע ניתוח זה עם קבצי פעילות אחרים. כל הפרמטרים שחולצו נשמרים בקובץ TXT של פרמטרי התאמת המודל וניתן להשתמש בהם עוד כדי לחבר פלט התנהגותי למנגנונים בסיסיים המווסתים את התנהגות הזבוב היומיומית הנשלטת על ידי דפוס פעילות המודל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית לכימות המאפיינים הזמניים של מקצבי תנועה צירקדיים בזבובים. באמצעות התאמת נתוני הפעילות של הזבובים לצורת גל של מודל רב-פרמטרי, המחקר מאפיין את שיאי הפעילות היומיים של הבוקר והערב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- כרונוביולוגיה
- ניתוח התנהגותי
רקע
- שעונים צירקדיים מווסתים תהליכים התנהגותיים ומולקולריים בבעלי חיים.
- זבובי פירות משמשים כאורגניזם מודל לחקר מקצבים צירקדיים.
- הקלטות תנועה חושפות תבניות פעילות מורכבות בתגובה למחזורי אור-חושך.
- הבנת מקצבים אלו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנונים ביולוגיים רחבים יותר.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל מתמטי לתיאור דפוסי פעילות של זבובים.
- כימות שיאי הפעילות המובחנים שנצפו בזבובים פירות.
- שיפור ההבנה של מנגנוני השעון הביולוגי מעבר למודלים המסורתיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקלטות תנועה של זבובים פירותים מסוג בר (wild type).
- ניתוח דפוסי פעילות תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות.
- התאמת נתוני פעילות למודל גל רב-פרמטרי.
- אפיון שיאי פעילות של בוקר וערב.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של שני שיאי פעילות נפרדים במקצב היומי.
- הדגמה של תבנית מורכבת ודו-מודאלית (biomodal) בניידות זבובים.
- פרמטרי המודל מתארים ביעילות את הצורה והגודל של שיאי הפעילות.
- תובנות לגבי מנגנונים נוספים המשפיעים על דפוסי התנהגות.
מסקנות
- השיטה המוצעת מספקת מסגרת חסונה לניתוח מקצבים צירקדיים.
- הממצאים תורמים להבנת נתונים התנהגותיים ביחס לשעונים צירקדיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מודל זה כדי לבחון היבטים אחרים של ביולוגיה צירקדית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות דפוסי תנועה צירקדיים ב-Drosophila מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות על ידי קישור פלטי התנהגות לפרמטרים קינטיים בסיסיים. גישה חישובית זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים באמצעות אספקת מדדים כמותיים וניתנים לשחזור לחקירת מסלולים. השיטה תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי סטנדרטיזציה של נתוני פעילות בימודליים מורכבים לפרמטרים הניתנים לפירוש לצורך שיתוף פעולה בין-תחומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות קינטיקת השיאים של הבוקר והערב במקצבי התנועה של זבובים.
- ערך תפעולי: מספק תשעה פרמטרים בלתי תלויים המתארים באופן מלא את צורת השיא וגודלו, לצורך הפחתת סיכונים ביולוגית עקבית.
- ערך אסטרטגי: תומך בביטחון חיזוי בבחירת מטרה על ידי הבהרת מנגנוני המצע מעבר לתנודות השעון המרכזי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים מדפוסים בי-מודאליים מורכבים כדי להבטיח מוכנות אמינה לסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מאפשר שחזור של הבדיקה באמצעות התאמה מבוססת-מודל של נתוני פעילות לגל בי-אקספוננציאלי (four-exponential waveform).
- ערך אסטרטגי: מקל על שימוש חוזר בפלטפורמה על ידי חילוץ פרמטרים ניתנים להשוואה בין תנאים גנטיים או פרמקולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין פנוטיפים התנהגותיים לתשתיות מכניסטיות העומדות בבסיס תהליכים המוסדרים על ידי השעון הביולוגי במערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בסנכרון של סממנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים על ידי מתאם בין פרמטרים שהופקו לבין תוצאות של נתיבים או מדדים מולקולריים.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי קידום פרויקטים מותאם-סיכון, על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במודלים פרה-קליניים מבוססי תנועה (locomotor).
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי המרה של נתוני תנועה גולמיים לפרמטרים כמותיים לצורך ניתוח המשך.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים על ידי מידול שיאי פעילות כפלט של אינטראקציות קינטיות של סובסטרט.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה ופלטים כמותיים באמצעות פרמטרים מותאמי-מודל הלוכדים את הדינמיקה של שיאי הבוקר והערב.
- אנליטיקה: מספקת פלטים סטטיסטיים הכוללים גובה שיא, רוחב וקצבי דעיכה לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מאפשר רציפות פרה-קלינית על ידי קישור מדדי התנהגות להורדת סיכונים מכניסטית במסלולים הקשורים לשעון הימממי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס מסגרת חישובית לשימוש חוזר לצורך סטנדרטיזציה של ניתוח התנהגותי צירקדיאדי במיזמים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות תובנה מכניסטית לגבי ויסות פעילות בי-מודאלי מעבר לשעונים תעתוקיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והדירות באמצעות התאמת מודל בעל תשעה פרמטרים של גלי תנועה.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת הפרויקט (go/no-go) על ידי הפחתת עמימות ביולוגית בפנוטיפים התנהגותיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על ניתוח כמותי של תרומות שיאי הבוקר והערב.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה צירקדית ובהתאמת מודלים וספקטרום מבוססת MATLAB.
- תלוי בתשתית לניטור פעילות ובמערכות אינקובציה מבוקרות של אור וחושך.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לפרוטוקולים של קיבוץ נתונים (binning), תיקון מגמות ובחירת שיאים.
- כולל שיקולי הסתגלות בעת יישום המודל על זני זבובים שאינם סטנדרטיים או על תנאים סביבתיים שונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות למגמות בקו הבסיס ותקופות הסתגלות חולפות ראשוניות בנתוני תנועה (locomotor data).
