מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה
4 בדצמבר 2012
כדי להבין את קשר בין התגובה החיסונית ובהתנהגות, שאנו מתארים שיטה למדידת התנהגות רצוניים ב דרוזופילה במהלך זיהום חיידקים, כמו גם את היכולת של זבובים לעלות תגובה חיסונית על ידי ניטור הישרדות, עומס בקטריאלי, ופעילות בזמן אמת של רגולטור מפתח של חסינות מולדת, NFκB.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את השינה ואת תפקוד מערכת החיסון ב-drosophila. מטרה זו מושגת תחילה על ידי תיעוד הפעילות הלוקומטורית של זבובים מזוהמים כדי למדוד שינה והישרדות; כשלב שני, הזבובים המזוהמים עוברים הומוגניזציה, דילול ופיזור על פלטות LB agar. מספר יחידות יוצרי המושבות (colony forming units) הגדלות מעיד על יכולתם של הזבובים לסלק את הזיהום.
בשלב הבא, זבובים נגועים המבטאים טרנסגן המכיל את הדיווחן (reporter) NF kappa b luciferase מתווספים לפלטת 96 בארות המכילה luciferian, הסובסטרט של luciferase. מדידה בזמן אמת של kappa b Luciferase מעידה על הפעלת מסלול איתות של NF kappa B במהלך זיהום, ובסופו של דבר על תוצאת ההישרדות במהלך שינה. סילוק חיידקים ופעילות של הדיווחן NF KB הם מדדים המספקים תובנה מכניסטית לגבי הקשר המולקולרי בין תפקוד חיסוני לבין התנהגות.
בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו מתקשים בה เนื่องจาก נדרשים זמן ותרגול כדי ללמוד כיצד להדביק זבובים באופן ידני בעקביות. היתרון העיקרי של הטכניקה המדווחת על ידי Lucifer על פני שיטות קיימות כגון QPCR הוא שניתן למדוד את פעילות NF Kappa B באופן רציף ובזמן אמת בזבובים חיים. התחילו בהדגרה של תרביות דרוזופילה בשלב פאופה מאוחר למשך שלושה עד ארבעה ימים, כדי שהבוגרים יסתגלו לתנאי הסביבה.
כאן הזבובים מועמדים לתאורה קבועה כדי לבטל את השפעת השעון הביולוגי על התגובה החיסונית וההתנהגות. לאחר מכן, העמיסו זבובים בני יום עד ארבעה ימים למכשירי ניטור הפעילות. המכשירים יתעדו את פעילותם למשך שלושה ימים לפחות לפני ההדבקה, עד יום אחד לפני מועד ההדבקה המתוכנן.
בחר מושבה בודדת של SIA באמצעות טיפ פטה סטרילי וטבול את הטיפ למבחנה המכילה חמישה מיליליטר של מצע LB כדי לוודא טכניקת עבודה סטרילית. אל תשכח להכין תרבית ביקורת (mock culture) ללא חיידקים. גדל את החיידקים למשך לילה עד שיגיעו למצב של שלב צמיחה אקספוננציאלי למחרת.
מדוד את בליעת האור (absorbance) של התרבית באורך גל של 600 nanometers. השתמש ב-Q vet שני כביקורת ריקה (blank). התרבית מוכנה כאשר הריכוז הוא בין 0.5 ל-1 יחידות בליעת אור לצורך תת-תרבית, או הארך את זמן הגדלת התרבית לפי הצורך.
כעת הכינו את התמיסה הבקטריאלית להדבקת הזבובים. דללו את הבקטריות ב-PBS עד להשגה של בולענות (absorbance) צפויה של 0.1 באורך גל של 600 nanometers. לאחר מכן, הוסיפו צבע מאכל עבור בקרת ההזרקה.
החליפו את החיידקים בתווך LB. שמרו את שני התמיסות על קרח. לאחר מכן, באמצעות שובך פיפטות (micro pipette puller), צרו מחטי הזרקה בעלות קצה דק תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
השתמשו בפינצטה עדינה כדי לשבור את קצהן של המחטים, כך שהפתח יהיה רחב מספיק כדי למלא אותו בנוזל ההזרקה באמצעות שאיבה, אך קטן מספיק כדי למזער את הנזק לזבוב. חברו מחט זכוכית למזרק פלסטיק של 3 cc באמצעות קטע צינור. זרימת תווך ההזרקה נשלטת באופן ידני.
הימנעו מזיהום צינור הגומי בנוזל ההזרקה, מכיוון שמערכת המזרקים משמשת הן להזרקה של החומר המדבק והן להזרקת הביקורת. ודאו את זרימת תווך ההזרקה באמצעות נייר ניגוב מסוג Kim wipe. שני פרטים קריטיים להצלחת ההזרקות הם שימוש בגודל המחט האופטימלי ואטימה מאובטחת בין המחט למזרק.
לאחר שמערכת ההזרקה מוכנה לחלוטין, הרדימו את הזבובים באמצעות זרימה מינימלית של פחמן דו-חמצני, ופעלו במהירות כדי ששום זבוב לא יישאר מורדם למשך יותר מחמש דקות. כעת, הזריקו לזבובים על ידי דקירת מחט הזכוכית באזור שמעל ה-scutellum של החזה הגבי (dorsal thorax). מעבר חומר ההזרקה אל תוך הזבוב מאומת באמצעות צבע מאכל, שניתן לראות כאשר התמיס המוזרק מתפשט.
לפני התחלת העבודה, ודאו כי כל החומרים המשמשים להליך זה עברו עיקור באוטוקלאב לפחות יום קודם לכן. הכינו צלחות פטרי בקוטר 10 סנטימטר עם מצע LV agar. ביום הניסוי, הרדימו את הזבובים והעבירו אותם למבחנות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.
הכינו לפחות שתי קבוצות של 10 זבובים בכל אחת לכל תנאי ניסוי. הכינו גם קבוצת ביקורת של זבובים ללא זיהום, במיוחד כאשר משתמשים בזן חיידקי ללא עמידות לאנטיביוטיקה. שמרו את כל המבחנות הטעונות על קרח.
בשלב הבא, הוסיפו 400 µL של מצע LB לכל מבחנה טעונה בזבובים. הומוגניזו את הזבובים באמצעות פניקל קטן ובצעו זאת בסמיכות ללהבה כדי למנוע זיהום. כעת, באמצעות טיפי פפיטה חתוכים, בצעו דילול סדרתי של ההומוגנאט במכפלות של 10 בנפחים של 200 µL.
אם ההומוגנאט הוכן מיד לאחר ההדבקה ב-sia, הכינו דילולים עד 1:1000, אך עבור הומוגנאט שהוכן 24 שעות לאחר ההדבקה, הכינו דילולים עד 1:100,000. לאחר מכן, זרעו את שני הדילולים הגבוהים ביותר בצלחות של 10 סנטימטר באמצעות כדורי זכוכית כדי להבטיח פיזור אחיד, והדגירו את הצלחות למשך הלילה. למחרת, ספרו את מספר המושבות בצלחת באמצעות תצפית ישירה או באמצעות תוכנה לספירת מושבות.
לאחר מכן, חשבו את מספר יחידות יוצרות המושבות לזבוב. בדיקה זו משתמשת בזבובים טרנסגניים הנושאים את השבב המדווח kappa b luciferase במועד המתאים. הבדיקה דורשת גם חיידקים בתרבית, כגון SCIA, שהוכשרו להזרקה כפי שמתואר בסעיף הקודם.
התאימו את הזבובים לתנאי התאורה הניסויים. בדוגמה זו, זבובים מסוג kappa b luciferase בני יום עד ארבעה ימים נשמרים במבחנות המכילות מצע מזון של 5% sucrose ו-2% agar, ומונחים בתאורה קבועה למשך יומיים. כעת הכינו פלטת מיקרו של 96 בארות עבור הזבובים.
מלאו כל באר בשתי שכבות של מזון. ראשית, הוסיפו לכל באר 300 microliters של תמיסת 5%sucrose ו-2%agar. כסו את הצלחת בבד רשת עדין והניחו לצלחת להתייבש לחלוטין למשך עד שעה.
בשלב הבא, הוסיפו לכל באער שכבה עליונה בנפח של 50 µL המכילה 5% sucrose, 1% agar ו-2 mM Lucifer. מכיוון ש-Lucifer רגיש לאור, יש להניח ללוחית להתייבש בחושך, ומהשלב זה ואילך, יש לצמצם את חשיפת הלוחית לאור.
לאחר שהאגר התקרר, כסו את הצלחת ביריעת דבק שקופה. לאחר מכן, בעזרת מחט דקה, צרו שני חורים ביריעה מעל כל באר. חורים אלו מאפשרים חילופי אוויר והרדמה גזית.
לאחר מכן, כדי להקל על העמסת הזבובים, השתמשו בלהב חד ובסרגל כדי ליצור חתך בין כל עמודה. הרדימו את הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני והעמיסו אותם אחד אחד לכל באר, עמודה אחר עמודה. במידה וזבוב נדבק לסרט, אפשרו לו לנסות להשתחרר בעצמו לפני שתתערבו.
החזירו את פלטת המיקרו-בארים (micro well plate) לאנקובטור תחת תאורה קבועה למשך שמונה עד 24 שעות. כדי להרדיש את הזבובים הכלואים בבארים, השתמשו בקצה של מיקרו-פיפט המחובר לקו פחמן דו-חמצני בלחץ נמוך. ודאו שהגז נמצא בלחץ נמוך שאינו מזיק, והניחו את קצה המיקרו-פיפט ישירות מעל חורי האוורור כדי להרדיש זבובים בקבוצות של שמונה באופן פרטני.
העבירו כל זבוב לפד CO2 והדביקו אותם בחיידקים כפי שבוצע בעבר. לאחר מכן, החזירו כל זבוב לבאר המקורית שלו וסגרו שוב את המיקרופלטה. מדדו את הלומניסצנציה בכל זבוב באמצעות לומינומטר הממוקם בחדר עם בקרת טמפרטורה תחת לוח זמנים מוגדר של תאורה.
הכניסו את המגשים לקסטת הערימה, תוך הקפדה לערום את המגשים המכילים את הזבובים בין מגשים שקופים וריקים. תכנתו את הלומינומטר בהתאם למפרטי היצרן ואספו קריאות בכל שעה למשך 24 שעות לפחות. בדוגמה זו, הגלאים תוכנתו לקרוא כל באר במשך 10 שניות.
עם סיום התהליך, ייצאו את קובצי הנתונים לגיליון אלקטרוני ובצעו ניתוח סטנדרטי הכולל גרף של התוצאות. ניתן לנתח את נתוני הדוגמה. ממוצעי ההנחות לשנייה חושבו משלוש קריאות לכל באער.
זבובים מסוג Canton S (wild type) וזבובים מוטנטיים מסוג relish. E 20, החסרים בגן NF kappa B, הוכנסו לשני ניטורי פעילות בתנאי תאורה קבועים והודבקו ב-sia. בדוגמה זו, ההדבקה קידמה שינה.
היה ברור שמוטנטים של relish E 20 חוו פחות שינה מאשר זבובים של Canton s. Control לאחר ההדבקה. בהתאמה לממצאים קודמים, מוטנטים של relish E 20 גם נספו במהירות מההדבקה בהשוואה לזבובים מסוג פרא.
מרבית הזבובים שרדו את הזרקה של ביקורת אספטית, מה שמעיד על כך שהזבובים נספו כתוצאה מהזיהום ולא בשל הפגיעה שנגרמה מההזרקה. מכיוון שמוטנטים של relish מתו במהירות רבה, רק זבובים מסוג Canton s שימשו להדגמת העומס הבקטריאלי לאחר זיהום. Sia המשיכה להתרבות בזבוב 24 שעות לאחר הזיהום.
פעילות הדיווח של הלוציפראז הראתה שונות רבה בין זבובים בודדים ובין נקודות נתונים מוצלחות. למרות שהאות נגזר מכל הרקמות בתוך הזבוב, לא צפוי שכל רקמה תפלוט את אותה כמות של אות, ונראות הרקמה לגלאי תשתנה ככל שהזבוב נע. בדוגמה זו, זבובים הודבקו והושוו לקבוצת ביקורת שעברה טיפול מקביל.
זבובים שמת הוסרו מהניתוח של קבוצת הזבובים. פעילות הדיווחן Kappa b Luciferase עולה באופן עקבי לאחר הדבקה. פעילות הדיווחן Kappa b Luciferase עלתה באופן עקבי גם לאחר פגיעה אספטית.
שיא הפעילות היה סביב 12 שעות הן לאחר הפגיעה והן לאחר הזיהום. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת את התפקוד החיסוני והשינה ב-SSO לאחר זיהום. אנו יכולים למדוד שינה, הישרדות, זמן, פינוי חיידקים ואת הפעילות בזמן אמת של reporter של שעתוק.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הקשר בין התגובה החיסונית לבין התנהגות ב-Drosophila על ידי מדידת פעילות מוטורית במהלך זיהום חיידקי. כמו כן, המחקר מעריך את התגובה החיסונית באמצעות שיעורי הישרדות, עומס חיידקי ופעילות של NF魏B, רגולטור מרכזי של החסינות המולדת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה התנהגותית
רקע
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודל לחקר תגובות חיסוניות.
- הבנת הקשר בין התנהגות לתפקוד חיסוני היא חיונית להשגת תובנות לגבי בריאות ומחלה.
- NF-κB הוא מרכיב קריטי בתגובה החיסונית המולדת.
- פעילות מוטורית יכולה לשקף את המצב החיסוני ואת הבריאות הכללית של הזבובים.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעות של זיהום חיידקי על השינה ועל תפקודי מערכת החיסון ב-Drosophila.
- למדידת פעילות מוטורית כמדד לבריאות לאחר זיהום.
- להערכת יכולתן של זבובים לסלק זיהומים חיידקיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקלטה של פעילות מוטורית של זבובי פירות (*Drosophila*) נגועים.
- הומוגניזציה של זבובים נגועים ופיזורם על מצע LB agar לספירת יחידות יוצרות מושבות (CFU).
- שימוש במדווח לוסיפראז למדידת פעילות NF-κB בזמן אמת.
- ניתוח הקשר בין שינה, הישרדות ותגובה חיסונית.
תוצאות עיקריות
- זבובים נגועים הראו דפוסי פעילות מוטורית משתנים.
- שיעורי ההישרדות היו במתאם עם היכולת לסלק זיהומים חיידקיים.
- מדידות בזמן אמת הצביעו על הפעלה של NF魏B במהלך זיהום.
- הממצאים מספקים תובנות לגבי הקשרים המולקולריים בין תפקוד חיסוני לבין התנהגות.
מסקנות
- המחקר מבסס שיטה לקישור תגובות חיסוניות לשינויים התנהגותיים ב-Drosophila.
- התוצאות מרמזות כי הפעלה חיסונית יכולה להשפיע על פעילות מוטורית ועל דפוסי שינה.
- מחקר זה מרחיב את ההבנה של הגומלין בין התפקוד החיסוני להתנהגות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות למגזר התעשייה
הבנת הקשר המכניסטי בין הפעלה חיסונית לבין שינויים התנהגותיים, כגון שינה, היא קריטית להפחתת סיכונים בתהליך התיקוף של מטרות טיפוליות בנוירואימונולוגיה. מדידה כמותית הן של התגובה החיסונית והן של התגובה הפנוטיפית במודל שניתן לביצוע גנטי מאפשרת הערכה מוקדמת של היפותזות טיפוליות. גישה זו תומכת בביטחון בתוצאות החזויות על ידי קישור בין מודולציה של מסלולים מולקולריים לבין תוצאות תפקודיות in vivo.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ציר החיסון-התנהגות על ידי קורלציה בין הפעלה של NF-κB לבין פנוטיפים של שינה.
- ערך תפעולי: מספק מערכת נגישה גנטית לבדיקת מעורבות מטרה (target engagement) וסיגנלינג של מסלולים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות על ידי קישור מדדים מולקולריים לעמידות וסבילות של האורגניזם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: קובע פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת שינה, הישרדות, פינוי חיידקים ואיתות חיסוני בזמן אמת.
- פלט כמותי: מייצר נתונים רב-פרמטריים הכוללים קינטיקה של לומניסצנציה, ספירת CFU ופרופילים של תנועתיות.
- יכולת הרחבה (Scalability): תואם לפורמטים של 96 בארות וללומנימטריה אוטומטית לסריקה בתושבה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל ויסות הדדי בין חסינות מולדת לבין התנהגות הרלוונטית לפנוטיפים המושרים על ידי זיהום.
- המשכיות תרגומית: שימור השליחונות של NF-κB תומך בהכללה למערכות יונקיים.
- תובנה מכניסטית: פעילות של רפורטר בזמן אמת מאפשרת ניתוח קינטי של דינמיקת המסלול במהלך חשיפה לגורם מחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בביולוגיה של גילוי על ידי מתן תיקוף תפקודי של מטרות חיסוניות באמצעות פנוטיפים התנהגותיים ושל עמידות.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת השערות באמצעות מדידה בו-זמנית של הפעלה חיסונית ותוצאי התנהגות.
- סינון: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות פרוטוקולי הדבקה מוגדרים ונקודות סיום כמותיות.
- אנליטיקה: בדיקות CFU ולוסיפרז של NF-κB בזמן אמת מספקות מדדים חיסוניים כמותיים ובעלי רזולוציית זמן.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פעילות של מסלולים מולקולריים לבין מנגנוני הישרדות וסבילות של המארח.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמה הניתנת להתאמה לפתוגנים מגוונים ולרקעים גנטיים שונים לשימוש חוזר בקמפיינים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור הדינמיקה של NF-κB לתוצאות של שינה והישרדות.
- ערך תפעולי: נהלי הדבקה וקריאה סטנדרטיים משפרים את השחזוריות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי הבחנה בין מנגנוני עמידות למנגנוני סובלנות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על קשרים תפקודיים בין מערכת החיסון להתנהגות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, מיקרו-הזרקה ומערכות דומיין-דיווח טרנסגניות.
- תלוי בתשתיות לומנימטריה ובטכניקה סטרילית להבטחת הדבקה עקבית.
- מחייב תיאום בין צוותים בנוגע לכימות שינה ולתזמון בדיקות חיסוניות.
- שיקולי התאמה כוללים השפעות של רקע גנטי על דיווח NF-κB ועל ארגניות של נתיבי פתוגנים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות באות הלוסיפראז עקב עומק הרקמה ותנועה, דבר המצריך אסטרטגיות נרמול.
