אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה
31 ביולי 2017
פרוטוקול זה פותח כדי לזהות כמותית מרכיבים microenvironment הגידול ב resioblastoma החולה resections באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ו ImageJ.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לזהות כמותית רכיבי מיקרו-סביבה של גידול בכריתת חולי גליובלסטומה באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ותמונה J. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרו-סביבה של הגידול, כגון כיצד רכיבים אלה נראים בדגימות חולים וכיצד אנו יכולים לקבוע יחסים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה לניתוח בדגימות מטופלים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת הבהרת המיקרו-סביבה המורכבת של גידול גליובלסטומה.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לעקוב מקרוב אחר תזמון ההתפתחות הכרומוגנית כדי למנוע התפתחות יתר ורוויה של הרקמה. התחל את הפרוטוקול על ידי ביצוע השטיפות המפורטות בפרוטוקול הטקסט הנלווה. יש לדלל תמיסת חשיפת אנטיגן עם pH גבוה על בסיס טריס ומים מזוקקים באמצעות המלצות היצרנים.
עברו לאחזור אנטיגן בתיווך חום על ידי הוספת תמיסת הסרת המסכה המדוללת לכלי שאינו אטום למיקרוגל. הנח שקופיות לתוך הכלי. לאחר מכן הנח את הכלי מחליק למיקרוגל.
לאחר מכן, הרתיחו את הכלי למשך 20 דקות בעוצמה גבוהה. עקוב אחר רמות הנוזל לאידוי ומלא את הכלי במים מזוקקים לפי הצורך. הניחו לדגימות להתקרר בתמיסה למשך שעה בטמפרטורת החדר.
מתאר את דגימת הרקמה עם הידרופובי כדי למזער את נפח הריאגנטים הדרושים לכיסוי הדגימה. לאחר מכן, צנרת בתמיסת חדירה מספקת, 100 עד 200 מיקרוליטר כדי לכסות את דגימת הרקמה. הסר והשליך את התמיסה וכסה שוב את דגימת הרקמה בתמיסת חדירה.
דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר עם תמיסת חסימה למשך שעה. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חסימה. למחרת, זהה נוגדנים ראשוניים באמצעות מגיב פולימרי פרוקסידאז חזרת המתאים לחיה המארחת העיקרית של הנוגדנים.
צנרת בתמיסת חדירות מספקת כדי לכסות את דגימת הרקמה ולדגור את הדגימה למשך חמש דקות. הסר והשליך את התמיסה וכסה את דגימת הרקמה בתמיסת חדירות פעם נוספת למשך חמש דקות. דגרו את המגלשות במי חמצן 0.3% ו-IX TBS למשך 15 דקות.
פתח את הדגימות עם מצע פרוקסידאז דיאמינובנזידין או דאב למשך שתיים עד 10 דקות עד להשגת עוצמת הכתם הרצויה. צבעו את הדגימות כדי לזהות גרעיני תאים, כגון עם המטוקסילין בהתאם לפרוטוקול היצרנים. לייבש דגימות עם 100% אתנול וקסילן.
לבסוף, הרכיב את הדגימות לצמיתות עם אמצעי הרכבה. שני אזורים מעניינים בכריתת הגידול שלנו, הגידול הראשוני בתפזורת והאזורים הסמוכים, המורכבים בעיקר מרקמה בריאה עם תאי סרטן פולשים מפוזרים, זוהו על ידי נוירופתולוג משתף פעולה על דגימות חולים מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין. אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית זיהתה צביעה חיובית לאסטרוציטים, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים בכל דגימת חולה.
ביצענו צביעה ללא נוגדן ראשוני לבקרה שלילית. היצרן המליץ על דילול נוסף לפני שהחליט על דילול של 1 עד 200 עקב צביעה חיובית אופטימלית של גוף התא ותהליך עם רקע מינימלי לנוגדנים נגד ALDH 1l1. באמצעות תמונה J, אחוז הכיסוי של צביעת אוליגודנדרוציטים חיוביים OSP-1 כומת כדי להשוות בסופו של דבר את ההבדלים באזורי העניין שלנו.
לאחר החלת הסף המתאים על התמונה, ניתן למדוד ולהשוות את אחוז הכיסוי מהסף עבור מספר חולים. חמישה אזורים סמוכים ובתפזורת של דגימות חולי גליובלסטומה או GBM, יחד עם רקמת מוח בריאה הושוו לכיסוי חלבון ספציפי לאוליגודנדרוציטים 1 או OSP1 אחוז. לאחר השליטה, ניתן לבצע את טכניקת הצביעה תוך ארבע שעות ביום הראשון ושעתיים ביום השני אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב מקרוב אחר עוצמת צביעת הרקמות והלחות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי כמותי של רכיבי סביבת המיקרו של הגידול בחתכים כירורגיים של מטופלים עם גליובלסטומה, באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ותוכנת ImageJ. טכניקה זו שואפת לספק תובנות לגבי סביבת המיקרו המורכבת של גידולי גליובלסטומה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- היסטולוגיה
רקע
- גליובלסטומה היא גידול מוחי אגרסיבי ביותר.
- למיקרו-סביבת הגידול תפקיד מכריע בהתקדמות הגידול.
- הבנת ההרכב של סביבה זו חיונית לפיתוח טיפולים ממוקדים.
- אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של רכיבי הרקמה.
מטרת המחקר
- להערכה כמותית של הסביבה המיקרוסקופית של הגידול במדגמי גליובלסטומה.
- לקביעת יחסים רלוונטיים פיזיולוגית בין סוגי תאים שונים.
- לספק שיטת ניתוח פשוטה עבור מדגמי חולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית לצביעת רקמות.
- תוכנת ImageJ לניתוח כמותי.
- פרוטוקולי שטיפה וחשיפה של אנטיגנים (antigen unmasking) לפי המלמות היצרן.
- ניטור קפדני של זמני הפיתוח הכרומוגני.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של רכיבים שונים של מיקרו-סביבת הגידול.
- ביסוס של שיטות לקביעת יחסי תאים בדגימות גליובלסטומה.
- תובנות לגבי המורכבות של מיקרו-סביבת הגליובלסטומה.
- הדגמת ישימותה של השיטה על דגימות מחולהים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה לחקר מיקרו-סביבות של גליובלסטומה.
- הוא מסייע בהבנת האינטראקציות בתוך מיקרו-סביבת הגידול.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על ממצאים אלה כדי לשפר אסטרטגיות לטיפול בגליובלסטומה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
ניתוח כמותי של הסביבה המיקרובית של הגידול בדגימות גליובלסטומה ממקור חולה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות תאי גליה בגילוי תרופות לנוירו-אונקולוגיה. על ידי אספקת מדידות הניתנות לשחזור וספציפיות לאזור של אסטרוציטים, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים, שיטה זו תומכת בתיקוף מטרות ובסריקה פנוטיפית במערכות הרלוונטיות למחלה. היא מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי קישור הרכב הסביבה המיקרובית לתגובה טיפולית ולמנגנוני עמידות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של פנוטיפים של תאי גליה ומצבם התפקודי בתוך אזורי גידול הטרוגניים.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות כמותיות מבוססות דימות להערכת מעורבות המטרה ו modulates של המיקרו-סביבה.
- ערך ניבוי: תומך בבחירת מטרה המותאמת לסמנים ביולוגיים על ידי קורלציה בין שכיחות תאי הגליה למדרגי פתולוגיה בדגימות מטופלים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: קובע פרוטוקולים סטנדרטיים של אימונוהיסטוכימיה התואמים לתהליכי דימוי ואנליזה בהסבב גבוה.
- פלט כמותי: מספק מדדי אחוזי כיסוי באמצעות ImageJ המאפשרים השוואות בין דגימות ובין אזורים.
- שחזור: מגדיר בקרות תזמון קריטיות לפיתוח כרומוגני על מנת להבטיח ספציפיות של האות ולמזער רעשי רקע.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בדגימות כריתה ממטופלים ממש כדי לשמור על נאמנות פתופיזיולוגית במחקרי תיקוף של מטרות.
- המשכיות תרגומית: גישור בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים על ידי הגדרת מדדים כמותיים להרכב תאי הגליה.
- הפחתת סיכונים: צמצום אי-הוודאות בהפחתת סיכונים ביולוגיים בטיפולים המכוונים לתאי גליה באמצעות אפיון ההקשר של המיקרו-סביבה.
שילוב של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), ובמיוחד עבור תוכניות של נוירו-אונקולוגיה המתמקדות במודולציה של המיקרו-סביבה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אפשור מיפוי מרחבי וכמותי של אוכלוסיות גליאליות ברקמות אנוש.
- סריקה: מייצר דפוסי צביעה סטנדרטיים וכמותיים שניתן להשתמש בהם להערכת השפעת תרכובות על הרכב המיקרו-סביבה.
- אנליזה: מספק מדידות של אחוזי כיסוי מבוססות סף המאפשרות השוואה סטטיסטית בין תנאים ניסויים.
- מחקר תרגומי: תואם לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים על ידי קישור צפיפות תאי גליה לאזורים היסטופתולוגיים רלוונטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה של IHC/ImageJ הניתן להעברה וחל: עבור מודלים של גליומה וגידולי מערכת העצבים המרכזית (CNS) אחרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה באמצעות ניתוח כמותי עם רזולוציה מרחבית של תאי גליה בדגימות חולים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לשחזור אנטיגנים, חסימה וזמני פיתוח.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות להמשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות באינטראקציות של המיקרו-סביבה של המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרופיהות מווסתות גליה המותאם לסיכון, בהתבסס על נתוני מעורבות במיקרו-סביבה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה וטיפול בדגימות נוירופתולוגיות.
- תלוי בתזמון אופטימלי של פיתוח כרומוגני למניעת רוויה של האות.
- מחייב פרוטוקולי סף (thresholding) סטנדרטיים ב-ImageJ לצורך כימות עקבי.
- דורש גישה לדגימות כריתה של גליובלסטומה ממקור חולה עם אזורי עניין (ROI) מסומנים.
- מוגבל על ידי הטרוגניות של הרקמה והצורך בניתוח ספציפי לאזורים כדי למנוע אותות מבלבלים.
