הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

המטרה הכוללת של ניתוח RNASeq זה בדגימות זחל דג זברה היא לזהות פרופילי ביטוי גנים עבור עוברים וזחלים של דג זברה וליצור הצהרות השוואתיות כמותיות לגבי שינויים בביטוי גנים בין דגימות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכל תחום שעבורו עוברים או זחלים של דג זברה הם אינפורמטיביים, כגון כיצד דיכוי של גן ממוקד אחד גורם לשינויים בביטוי גנים או לשיבוש של מסלולים מסוימים ביחס לתנאים אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שדגי הזברה ניתנים לייצור של מספר רב של בעלי חיים, וניתן להשיג בקלות נתוני טרנסקריפטום של בעלי חיים שלמים.

בנוסף, ניתן להשיג בידוד של סוגי תאים ספציפיים בקלות באמצעות מיון של בעלי חיים טרנסגניים. מי שידגים את ההליכים יהיו ליין הוסטלי, סטודנטית לתואר שני, וג'סיקה נסמית', פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, תרבית עוברים עד גיל שלושה חודשים, שהוא בגרות רבייה.

הפרד שני דגים זכרים בוגרים ושלוש נקבות מהזן הרצוי למיכלי הזדווגות מחולקים של מי מערכת מתוקים בערב שלפני איסוף העוברים. למחרת בבוקר, לאחר שהאורות נדלקים, הסירו את המחיצה, ואפשרו לדגים להזדווג באופן טבעי עד שנצפו עוברים בתחתית המיכל. אסוף עוברים במרווחים של 30 דקות בצלחות פטרי נפרדות של מדיום עוברי עד לאיסוף המספר הרצוי.

כדי לשלב את העוברים, תרבית אותם בקבוצות של 50 עד 75 לצלחת פטרי של 10 סנטימטר כדי לקדם תזמון התפתחותי עקבי של כל העוברים. לאחר מכן, שמור את הצלחות על 28.5 מעלות צלזיוס. מדוד את גיל העובר באמצעות מספר סומיט לאחר פילוח עד כ-24 שעות לאחר ההפריה, או HPF, והפרד את העוברים על סמך גיל ההתפתחות.

לאחר המתת חסד של עוברים בשלב הרצוי על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו מאגר של 20 עוברים לצינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הסר את כל המדיום העוברי העודף מצינור המיקרו-צנטריפוגה. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב ליזה לצינור.

והשתמש בעלי כדי להומוגניזציה מכנית של העוברים. לאחר מכן, הוסף עוד 800 מיקרוליטר של ריאגנט ליזה כדי להביא את הנפח הכולל למיליליטר אחד. כדי לחלץ את ה-RNA, הוסף מגיב ליזה לדגימה שנאספה ודגר אותה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.

הוסף 0.2 מיליליטר כלורופורם לכל 1 מיליליטר של מגיב ליזה בשימוש, והפוך את הצינורות ביד למשך 15 שניות. לאחר דגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שתיים-שלוש דקות, צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 12,000 פעמים G ו-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. העבירו את השלב המימי המופרד לצינור טרי והוסיפו 0.5 מיליליטר איזופרופנול לכל 1 מיליליטר של מגיב ליזה בשימוש.

לאחר דגירה של הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 75% אתנול ל-RNA וצנטריפוגה את הצינורות ב-7, 500 פעמים G ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הסר לחלוטין את הסופרנטנט ואפשר לדגימה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השעו מחדש את ה-RNA ב-15 עד 30 מיקרוליטר של מים שטופלו ב-DEPC. כדי לטהר RNA באיכות גבוהה לאחר חילוץ הגלולה ושטיפת הדגימה על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בספקטרופוטומטר ספיגה כדי לבדוק את ה-RNA המופק לריכוז וטוהר. ודא שהערך של 260 מעל 230 הוא בערך 2.0 לפני שליחת דגימות ה-RNA לספק או לחיל לצורך ניתוח RNASeq ושינוי ביטוי גנים על סמך כימות קריאות ריצוף.

כדי להשוות מצב ניסוי בודד לעומת בקרה, פתח את הנתונים של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בתוכנת ניהול גיליונות אלקטרוניים. בחר את החץ הנפתח לצד לחצן המיון ובחר מיון מותאם אישית בתוך הגיליון האלקטרוני. בחלון שצץ, בחר את התיבה מתחת לעמודה ובחר למיין לפי העמודה LFC.

בעמודה מיון לפי, ודא שערכים נבחרו. בעמודה הזמנה, בחר כדי למיין מהגדול ביותר לקטן ביותר ולחץ על אישור. כדי לקבוע גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי שנמצאו בשני תנאי ניסוי, בגיליון האלקטרוני הניסיוני לעומת הביקורת, בחר את התא הראשון בעמודה ריקה.

לאחר מכן, הקלד את המשוואה הבאה בתא. הקש Enter או Return כדי להפעיל את המשוואה. בחר את התא המכיל את המשוואה ולחץ על התיבה בפינה השמאלית התחתונה של התא.

המשך ללחוץ על העכבר וגרור את האזור שנבחר לאורך כל העמודה עד לבחירת מזהה התכונה האחרון כדי להעתיק את המשוואה לכל תא בעמודה. בחר שוב מיון מותאם אישית והוסף רמה שנייה של מיון על-ידי לחיצה על סמל הפלוס בפינה הימנית התחתונה. ברמה הראשונה, מיין לפי, תחת עמודה, בחר שכפל.

תחת מיין לפי, בחר ערכים, ותחת סדר, בחר Z כדי A.In לרמה השניה, ולאחר מכן, תחת עמודה, בחר LFC. תחת מיין לפי, בחר ערכים, ותחת סדר, בחר מהגדול ביותר לקטן ביותר ובחר אישור. כדי להסיר סוגריים מעמודת סמלי הגנים לפני שתמשיך, בחר את כל העמודה המכילה סמלי גנים.

בחר ערוך ולאחר מכן החלף בתפריט הקובץ הנפתח. הקלד סוגריים פתוחים, כוכב, סוגריים סגורים, בסרגל מצא איזה של חלון ההחלפה, וחכור את ההחלפה עם סרגל ריק. בחר Replace All כדי להסיר את כל המופעים של סוגריים.

לקביעת מסלולים מועשרים, העתיקו את סמלי הגנים הרצויים ללוח. עבור אל ConsensusPathDB ולאחר מכן בחר ניתוח ערכת גנים בסרגל הצד השמאלי של דף האינטרנט, ואחריו ניתוח ייצוג יתר. בתיבה הדבק רשימת מזהי גנים וחלבונים, הדבק את רשימת הגנים.

בחר את סמל הגן בתיבת סוג מזהה הגן/חלבון ולחץ על המשך. תחת המקטע קבוצות מבוססות נתיב, בחר את התיבה לצד מסלולים כפי שהוגדרו על-ידי מסדי נתונים של נתיבים. בחר מצא קבוצות מועשרות כדי לקבל את רשימת המסלולים המכילים גנים ברשימת הקלט.

בחר את כל המסלולים המועשרים להצגה חזותית ברשת נתיבים על-ידי בחירת כל תיבה לצד שמות הנתיבים, או, תחת בחר בכותרת העמודה מעל תיבות הבחירה, לחץ על הכל. לאחר מכן, בחר הצג באופן חזותי את הקבוצות שנבחרו. התאם את מסנני החפיפה היחסית והמועמדים המשותפים על-ידי בחירה באחת מהתיבות במרכז העליון של הדף והזנת האחוז הרצוי, החפיפה היחסית או מספר המועמדים המשותפים, ולאחר מכן בחר החל.

כדי לקבוע את האונטולוגיות של הגנים המועשרים, העתק את סמלי הגן של הקבוצה המתאימה ללוח. עבור לכלי ניתוח העשרת GO בקונסורציום אונטולוגיה גנטית. בצד שמאל של הדף, מתחת למזהי הגנים שלך כאן, הדבק את רשימת סמלי הגנים בתיבה.

מתחת לתיבה מזהי גנים, בחר את המונח go, תהליך ביולוגי. לאחר מכן, בחר danio rerio מתחת לתיבה תנאי go ולחץ על שלח. בצע QRT PCR והשווה ל-RNASeq, על פי פרוטוקול הטקסט.

ריצוף של RNA מופק מזחלים שהוזרקו עם מורפולינוס כנגד alms1 או bbs1 חשף את הגנים שהיו מווסתים באופן ייחודי למעלה ולמטה במודלים של אלסטרום ו-BBS, כמו גם את הגנים שהשתנו באופן משמעותי בשני המודלים. כדי להבהיר בצורה ברורה יותר את הפרופיל המולקולרי של מודל אלסטרום, זוהו המסלולים והאונטולוגיות של הגנים המועשרים בגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. כפי שמוצג כאן, 31 מסלולים בסך הכל הוסדרו.

מלבד הקבוצה הרחבה של חילוף החומרים, המסלולים המושפעים ביותר היו מערכת החיסון המולדת והנרכשת, עם 32 ו-20 גנים בהתאמה. אירועי איתות של קולטני תאי B במורד הזרם הועשרו גם הם. מספר מסלולי איתות הועשרו גם בין הגנים המווסתים, בהתאם לקשר של תסמונת אלסטרום עם תפקוד לקוי של סיליום ראשוני.

בנוסף, שלושה מסלולים הקשורים להפרשת אינסולין היו מווסתים, חומצות שומן קשורות ל-GPR40, חומצות שומן חופשיות ואצטילכולין. לבסוף, שישה מונחי GO הועשרו בין הגנים המווסתים במודל אלסטרום, כולל התמיינות אריתרוציטים, הומאוסטזיס אריתרוציטים, הומאוסטזיס של תאים מיאלואידים ותהליכים הומאוסטטיים. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ניתוח המסלול ומונחי GO תוך פחות משעה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שבחירת פרמטרי מסלול וערכי חיתוך הם השיקולים החשובים ביותר בפירוש התוצאות של השוואות ביטוי RNASeq. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו יישום עם קווים מוטנטיים וניתוח טרנסקריפטום של סוגי תאים בודדים על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו פרופיל טרנסקריפטום של סוגי תאים ושינויים בביטוי גנים בשליטת גנים ספציפיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בנתונים טרנסקריפטומיים של דג הזברה שנוצרו על ידי RNASeq לזיהוי שינויים משמעותיים בביטוי גנים בין דגימות ניסוי.