Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

פרוצדורה זו מתחילה עם cDNA שסונתז מתבנית של RNA באיכות גבוהה. ראשית, ה-cDNA מסומן בצבע הפלואורסצנטי Cy3. עם השלמת תגובת הסימון, ה-cDNA המסומן עובר טיהור ובידוד, ואיכות תגובת הסימון מוערכת.

ה-CDNA המסומן עובר היברידציה למערך זעיר (microarray). לאחר ההיברידציה, המערכים מנותחים כדי לקבוע את רמות הביטוי הגנתי היחסיות בדגימות. שלום, שמי סאם פטרסון מהמעבדה של ד"ר ג'ניפר פרימן בבית הספר למדעי הבריאות באוניברסיטת פרדו.

בעבר, הראינו לכם כיצד למצות RNA מעוברים של דגי זברפיש ולהפוך את ה-RNA הזה ל-CDNA. היום נראה לכם את הפרוצדורה לסימון ולהibrדיזציה של ה-CDNA הזה על פלטפורמת Oligonucleotide Microarray של דגי זברפיש, כדי לחקור פרופילי ביטוי גנים גלובליים. בדרך כלל, אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור ביטוי גנים דיפרנציאלי בתגובה לחשיפה לרעלן.

בואו נתחיל. ניסוי המיקרו-מערך (microarray) דורש סביבה עם תאורה מינימלית כדי למנוע דגרדציה פוטו-כימית של הצבע הפלואורסצנטי Cy3 המשמש לסימון. כדי להתחיל את סימון ה-cDNA עם Cy3, הפשר את הרכיבים הבאים של מערכת הסימון הגנומי BioPrime Array CGH: בופר פרימרים אקראיים (random primer buffer) בריכוז 2.5x, תערובת dNTPs בריכוז 10X ומים נטולי נוקלאז. בנוסף, הפשר את מלאי ה-dCTP המסומן ב-Cy3 בריכוז 1mM. לאחר ההפשרה, סובב קצר במצנטריפוגה את הרכיבים ושלב אותם בתוך מבחנה בעלת דפנות עבות בנפח 0.6 milliliters.

500 nanograms של cDNA ב-40 microliters, 2.5 x random primer buffer ומים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) כדי להגיע לנפח כולל של 86 microliters. ערבבו היטב וסבבו קצרה בצנטריפוגה, ולאחר מכן דגרו את התגובה בטמפרטורה של 100 °C בטרמוסייקלר למשך חמש דקות. בסיום הדגירה, העבירו מיד את התגובה לאמבט קרח למשך 10 דקות.

בשלב הבא, הוציאו את ה-exo DNA polymerase מהמקפיא והניחו על קרח. לאחר מכן, הוסיפו למבחורת התגובה 10 µL של 10 X-D-C-T-P Mix, 2 µL של 1 mM SI 3D CTP ו-2 µL של XO cleanout DNA polymerase, ערבבו היטב וסובבו במרכז centrifuge לזמן קצר. לבסוף, דגרו את התגובה ב-37 °C למשך 16 שעות בטרמוסייקלר עד לסיום הסימון.

המשיכו לניקוי והשקיע של ה-CDNA המסומן. כדי להתחיל בניקוי ה-CDNA המסומן, הניחו עמודת MicroCon לתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר.

הוסיפו 300 µL של 0.1 XSSC לעמודה ולאחר מכן הוסיפו את תגובת הסימון. סובבו את העמודה בצנטריפוגה ב-16,100 G למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. שימו לב כי הנוזל שעבר סינון עשוי להיות בצבע ורוד בהיר.

שפשפו את הנוזל שעבר דרך העמודה (flow through) והוסיפו 300 µL נוספים של 0.1 X SSC לעמודה. לאחר מכן, חזרו על הסנטריפוגציה ב-16,100 G למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. שוב, שפשפו את הנוזל שעבר והוסיפו 300 µL נוספים של 0.1 X SSC לעמודה, וכעת סנטריפוגו ב-16,100 G למשך 12 דקות בטמפרטורה של 4 °C לאחר שטיפה זו האחרונה.

הנוזל שעבר (flow through) צריך להיות צלול וניתן להבחין ב-CDNA המסומן בצבע ורוד על העמודה. שוב, השליכו את הנוזל שעבר משטיפה סופית זו כדי להוציא את ה-CD NA המסומן. הוסיפו 100 µL של מים נקיים מנוקליאז (nuclease free water) לעמודה. הוציאו את העמודה מתוך מבחנת המיקרו-צנטריפוגה והפכו אותה לתוך מבחנה חדשה.

לאחר מכן, סבבו את העמודה באופן הפוך וסבבו אותה בצנטריפוגה במהירות של 2,300 G למשך שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. ה-CDNA המסומן מומס במים בתחתית המבנה. בדקו את ה-CDNA שהתקבל באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop ND 1000 בהתאם להוראות היצרן.

חשבו את ריכוז ה-DNA והעריכו את שילוב הצבע כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. אם ה-CDNA מסומן מספיק, העבירו שש מיקרוגרם לשפופרת חדשה כדי להשקיע את תערובת ה-CD NA המסומנת בנפח של 0.1 x של נתרן אצטט 3 molar ב-pH 5.2 ונפח של one x של Isopropanol, תוך דגירה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

יש לזכור שכל השלבים עד לנקודה זו בוצעו בסביבה עם תאורה מינימלית. לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-16,100 G למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבוב, השליכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע ה-DNA, שצבעו ורוד.

לבסוף, שטפו על ידי הוספת 500 µL של 70% ethanol וערבבו על ידי היפוך עדין, ולאחר מכן צנטריפוגו ב-16,100 G למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הסירו את העלייה (supernatant), הפכו את המבחנה והניחו למשקע להתייבש למשך חמש דקות. ה-CDNA המסומן מוכן להיברידיזציה.

לפני תחילת ההיברידיזציה, הפעל את מערכת ההיברידיזציה של nimble gen והמתן עד שתגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 42 °C. התחל בהמסת פלט ה-CD NA המסומן בחמישה מיקרוליטרים (5 µL) של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) עד להמסה מלאה של הפלט. הוסף את רכיבי ההיברידיזציה מערכת ה-Roche Nimble Gen Hybridization kit, הכוללים את ה-Hybridization buffer hybrid A ואת ה-alignment oligo, לנפח כולל של 18 µL, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב המצורף.

ערבבו היטב וסובבו את המבחנה לזמן קצר (spin) כדי לרכז את התוכן בתחתית. לאחר מכן, דנאטורו את ה-CDNA המסומן על ידי הנחת המבחנה בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. העבירו מיד את המבחנה למערכת ההיברידיזציה nimble gen עד שהמערכים (arrays) יהיו מוכנים.

שימו לב כי המיקרו-מערכים דורשים טיפול ואחסון זהירים. מערכי Roche nimble gen מאוחסנים בחושך עם חומר מייבש בטמפרטורת החדר. טענו את המערך לכלי יישור המערבל המדויק (precision mixer alignment tool).

העמיסו את ה-PMA T load ב-X one mixer על ה-PMA T והסירו את פס הדבק באמצעות פינצטה. כאשר המערך והערבבל מוטמעים, סגרו את ה-PMA T בבטחה. לאחר מכן, שחררו את המערך ואת הערבבל מה-PMA T על ידי הפעלת לחץ על הערבבל דרך החור ב-PMA t.

לבסוף, השתמשו במגלגל (brayer) כדי להפעיל לחץ מסביב לדפנות החיצוניות של המערבל, על מנת להבטיח שהמערך אטום ולהוציא בועות אוויר. לאחר מכן, הניחו את קומפלקס מערבל המערך על מערכת ההיברידיזציה לחימום, כדי להטעין את דגימת ה-CDNA אל המערך. השתמשו בבקר התזוזה לאט ובלחץ קבוע.

הוסף 15 µL מהדגימה המסומנת לתוך פתח המילוי במרכז המערבל. נגב שאריות דגימה מפתחי הנקבים ואטום אותם באמצעות סרטי דבק. לאחר מכן, סגור את התפסים.

כעת התחילו לערבב את תמיסת ההיברידיזציה באמצעות תוכנית B במערכת ההיברידיזציה של nimble gen. אפשרו למערך המיקרו-מערך (microarray) לעבור היברידיזציה למשך 16 עד 20 שעות. לאחר ההיברידיזציה, המיקרו-מערך יישטף וייסרק כאשר תהליך ההיברידיזציה יקרב לסיומו. הכינו את הסריקה על ידי הדלקת הסורק של gene picks 4,000 B array והמתינו כ-15 דקות לחימומו.

בשלב הבא, הכין תמיסות שטיפה אחת A, אחת B, שתיים ושלוש, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. חמם מראש את תמיסת שטיפה אחת A ל-42 °C, אך השאר את שאר התמיסות בטמפרטורת החדר. כאשר תמיסת שטיפה אחת A תגיע לטמפרטורה הרצויה, שפוך אותה לתוך צלחת.

טבול מתקן שקופיות בבפר שטיפה one B. כעת הוצא את קומפלקס מערבל המערך ממערכת ההיברידיזציה nimble gen והזלק אותו לתוך הג'יג. התחל את השטיפה על ידי טבילת המכלול בבפר שטיפה one A שחומם מראש, והסר בזהירות את המערבל על ידי קילופו מהשקופית. לאחר מכן, הוצא את המערך מהג'יג ונער אותו במשך 15 שניות בבפר שטיפה one A. העבר במהירות את המערך למתקן שקופיות הטבול בבפר שטיפה one B ונער את מתקן השקופיות בעוצמה במשך שתי דקות.

לאחר מכן, העבירו את מתקן השקופיות למסלק שטיפה שני ונערהו במשך דקה אחת. לבסוף, העבירו את מתקן השקופיות למסלק שטיפה שלישי ונערהו במשך 15 שניות. השלימו את שלבי השטיפה על ידי העברת המערך לצנטריפוגה לייבוש שקופיות וסובבו למשך שתי דקות לאחר הצנטריפוגה.

סרוק את המערך באופן מיידי כיוון שה-D רגיש לאור ולאוזון; התחל את הסריקה על ידי טעינת המערך כאשר ברקוד המערך פונה כלפי מטה לתוך הסורק של מערכי gene picks 4, 000 B. בתיבת הדיאלוג של הגדרות החומרה, הגדר את ערך ה-PMT של הלייזר של 532 nanometer ל-500, הגדר את ההספק ל-100%, את גודל הפיקסל לחמישה microns, את מספר הקווים לממוצע (lines to average) ל-1 ואת מיקום המיקוד (focus position) ל-0 microns. כאשר ההגדרה הושלמה, בצע תצוגה מקדימה של המערך.

בחרו אזור לסריקה ולאחר מכן סרקו אותו. עם סיום הסריקה, בדקו את ההיסטוגרמה של התמונה. באופן אידיאלי, ספירה נורמלית של 1E-5 צריכה להיות בגבול הרוויה של 65,000, מה שמעיד על כך שכ-1% עד 2% מהמאפיינים נמצאים ברוויה.

אם הספירות הנורמליזציות הן פחות מ-1E-5, הגבירו את הגבייה (gain) של ה-PMT וסרקו מחדש את השקופית. אם הספירות הנורמליזציות הן יותר מ-1E-5, הנמיכו את הגבייה של ה-PMT וסרקו מחדש את השקופית, שמרו את התמונה, והשתמשו בתוכנה לניתוח נתונים לצורך נורמליזציה של הנתונים וחישוב ערכי העוצמה. תגובת הסימון מניבה באופן שגרתי לפחות 10 µg של cDNA מסומן.

ניתן לחשב את שילוב הצבע באמצעות יחס צבע בסיס פשוט, שבו היחס בין הנוקלאוטיד ל-SI three שווה ליחס A two 60 ל-a five 50 כשהוא מוכפל ב-23.15. תגובה טובה תביא לערך שבין 50 ל-80. היברידיזציה מקובלת תגרום לרוויה של 1% עד 2% מהמאפיינים.

ערכי ספירה מנורמלים של 1E-5 במגבלת רוויה של 65,000. כאשר ערך ה-PMT מוגדר, סביב 500, ניתן להעריך איכותית גם את איכות ההיברידיזציה על ידי צפייה בתמונה הסרוקה של המיקרומערך והערכת העוצמה של האוליגנוקלאוטידים המסודרים לעומת מאפיינים אחרים במערך. יש לבחון את התמונה הסרוקה גם לאיתור כתמים ספציפיים או נקודות אבק בתוך אזור המערך.

בניתוח המשכי, ניתן להשתמש בתרשים פיזור כדי להציג את הנתונים המנותחים שלכם, על מנת לקבוע רמות יחסיות של ביטוי גנים בדגימות ולזהות גנים המבטאים ביטוי דיפרנציאלי. גנים עם ביטוי דיפרנציאלי יסטו באופן משמעותי מקו ההתאמה הטובה ביותר. בהליך משלים, הצגנו כיצד להפיק RNA מעוברים של zebrafish ולסנתז cDNA. כאן הדגמנו כיצד לסמן ולביצוע היברידיזציה של cDNA על פלטפורמת מיקרומערך אוליגונוקלאוטידית כדי לחקור פרופילים גלובליים של ביטוי גנים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו תמיד להשתמש ב-CD NA באיכות גבוהה ולהימנע מחשיפת צבע השלושה (three dye) לתאורה ישירה. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.