זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לאפיין תהליכי התפתחות מוקדמים של המוח של תאי קודמן עצביים אנושיים בצורה מהירה וניתנת לשחזור, ולהגדיר את ההשפעות של גורמים חוץ-תאיים חשובים בוויסות תהליכים אלה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות חשובות בתחומי הנוירופסיכיאטריה והפרעות נוירו-התפתחותיות, כגון האם לכל האנשים המושפעים יש את אותה חריגה תאית, או לחילופין, האם כל אחד מהם מציג תפקוד לקוי ספציפי של האדם? היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו הוא שהוא מהיר, ניתן לשחזור וקל ליישום.

למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לספק תובנה לגבי הפרעות נוירו-התפתחותיות, ניתן להשתמש בה גם לחקר הפרעות ניווניות ונוירו-פסיכיאטריות כגון אלצהיימר ודיכאון. הדגמה חזותית של חלק מהשיטות הללו נחוצה מכיוון שטכניקות מסוימות כוללות העברת תאים מצלחת אחת לאחרת או דורשות ניתוחים מורפולוגיים המועברים בצורה הטובה ביותר באמצעות הדגמה חזותית. כדי להרים את תאי המבשר העצביים האנושיים, שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם מי מלח 1X פוספט.

שאפו את תמיסת המלח הפוספטית והוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים 1X לבאר עם תאי המבשר העצביים. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה P1000 כדי להוסיף 500 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט שנשמר בטמפרטורת החדר כדי לשטוף ולהסיר את התאים.

לאחר מכן, העבירו את התאים במי מלח חוצצים פוספט לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. שוטפים את הבאר שוב עם מיליליטר אחד של מי מלח חוצצים פוספט ומעבירים את הכביסה לצינור. לאחר מכן, סובב את התאים ב -300 גרם למשך חמש דקות ליצירת הגלולה.

לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה באחד עד חמישה מיליליטר של מדיום DMEM F12 שחומם מראש. צלחת 100,000 תאים בבארות משולשות בצלחת של 24 בארות. לאחר 46 שעות, הוסיפו תימידין טריטי למדיום התרבות ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן, לאחר הסרת המדיום, הוסיפו 300 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין EDTA שחומם מראש ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לפרק את התאים ולשחרר את הדנ"א. לאחר מכן, הפעל את קציר התאים והפעל. הנח נייר סינון בקציר התאים.

המשך לאסוף את הצינורות של קציר התאים במגש ריק ריק. לאחר מכן, לחץ על שטיפה מוקדמת כדי להרטיב את נייר המסנן. הניחו את צינורות האיסוף בבארות דגימה והתחילו.

השתמש במקור אור חם כדי לייבש את נייר הסינון ולסדר בקבוקונים מתאימים על המגש. מחוררים צ'אדים מנייר לתוך הבקבוקונים ואז מוסיפים שני מיליליטר קוקטייל נצנוץ נוזלי לכל בקבוקון. דגרו את הבקבוקונים למשך שעה אחת במונה הנצנוץ לפני הפעלת המכונה כדי לקבל את הספירה לדקה של כל דגימה המשקפת את סינתזת ה-DNA הפעילה.

זרע 500,000 תאים בצלחת תרבית של 35 מילימטר. לאחר מכן, מערבבים את המנה לכל הכיוונים כדי לפזר את התאים באופן שווה. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 46 שעות.

לאחר מכן, הוסיפו לתרבית שני מיקרוליטר למיליליטר של חמישה מילי-מולרי EdU ודגרו למשך שעתיים. לאחר מכן, נתקו את התאים וגלו אותם. לגלולת התא, הוסף שלושה מיליליטר של מדיום התפשטות של 30% עם או בלי גורמי גדילה או תרופות.

צלחת מיליליטר אחד של מתלה התאים על הכלים המצופים מראש ודגירה על הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. כדי לחקור את מספר תאי המבשר העצבי בתרבית, לאחר יומיים, יש לתייג ולהכין צינורות מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, שאפו את המדיום מהבאר והוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים 1X ודגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר ניתוק התאים, הוסף 300 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט 1X לכל באר. השתמש בפיפטה P1000 כדי לפיפטה תמיסת תאים מספר פעמים ולנתק את התאים מהצלחת. לאחר מכן, העבירו את תמיסת התא לצינור המוכן של 1.5 מיליליטר והפכו את הצינור פעמיים-שלוש.

בעזרת פיפטה, משוך 50 מיקרוליטר תאים באמצע הצינור והוסף לתמיסה כחולה טריפן בצינור של 0.5 מיליליטר. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. כדי ליצור את הנוירוספירה, פיפטה מיליליטר אחד של 100% מדיית התפשטות לתוך צלחת של 35 מילימטר ללא כל מצע ציפוי.

לאחר מכן, הוסיפו מיליון תאי מבשר עצביים בכל אחת מהלוחות הללו ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 עד 96 שעות. כדי להכין את הצלחת לנדידת נוירוספרה, ממיסים אליקוטי ג'ל מחקים ECM בשישה מיליליטר של מדיום התפשטות של 30%. הוסף מיליליטר אחד של ג'ל מחקה ECM עם מדיום הרחבה של 30% בבאר אחת של צלחת של שש בארות.

לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי לצלחת את הנוירוספרות, השתמש בפיפטה כדי לאסוף את התאים בתווך מצלחת 35 מילימטר ולהעביר אותם לצינור חרוטי. לאחר מכן, סובב את הצינור ב-100 G כדי לגלול את הנוירוספרות.

לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה באחד עד שלושה מיליליטר של מדיום הרחבה של 30% שחומם מראש. לאחר מכן, פיפטה 200 מיקרוליטר של הנוירוספרות התלויות לתוך צלחת שש הבארות המכילה את הג'ל מחקה ECM עם מדיום התפשטות של 30% ונדנד את הצלחת. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

שאפו את הג'ל המחקה ECM עם מדיום הרחבה של 30% ולאחר מכן קבעו את התאים למשך 30 דקות באמצעות 4% פרפורמלדהיד. כדי לנתח את הנוירוספרות, צלם תמונות באמצעות הגדרות ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 10. השתמש בתוכנת NIH ImageJ כדי למדוד את הנדידה הממוצעת של הנוירוספרות.

ב-ImageJ, השתמש בכלי הקו החופשי כדי לעקוב אחר קווי המתאר החיצוניים של הנוירוספירה. לאחר מכן, השתמש בפונקציית מדידה כדי לחשב את שטח העקבות, ולעקוב אחר מסת התא הפנימית של הכדור. הפחיתו את מסת התא הפנימית מאזור הנוירוספירה הכולל כדי לכמת את הנדידה הממוצעת.

הצביעה האימונוציטוכימית נעשתה כדי לחקור את הביטוי של חלבוני שלד ציטו וגורמי שעתוק כגון SOX2, PAX6 ונסטין בתאי קודמן עצביים במעבר השלישי. לאחר מכן, צולמו תמונות ניגודיות פאזה כדי לזהות את התאים נושאי הנויריטים. מהתמונה, תאים עם תהליכים שווים או ארוכים משני גופי תאים נחשבים נושאי נויריט, בעוד שתאים עם תהליכים קצרים משני גופי תאים אינם נחשבים נושאי נויריט.

כדי לאשר את היווצרות הנוירוספרה, צולמו תמונות ניגודיות פאזה המראות כי נוירוספרות שנאספו בנקודת הזמן של 72 שעות הן בגודל של בין 80 מיקרומטר ל-120 מיקרומטר, ולכן ניתן להשתמש בהן לבדיקת נדידה. כדי להגדיר את יכולת ההתפשטות, תאי מבשר עצביים גודלו בתנאי בקרה או גורם גדילה פיברובלסטים ונצבעו לנוכחות EdU. התמונות הפלואורסצנטיות של ניגוד הפאזה מראות כי לתאים שטופלו בגורם גדילה פיברובלסטים יש שיעור גבוה יותר של תאים המעורבים בשלב S כפי שמוצג על ידי צביעת EdU.

לאחר מכן, כדי לבדוק צמיחת נויריטים, התאים נבדקו בתנאי ביקורת והושוו ל-PACAP. תמונות ניגודיות פאזה צולמו והראו עלייה במספר התאים עם נויריטים בטיפול PACAP. לאחר מכן, כדי להבין את נדידת הנוירוספרה, התאים טופלו בנוירופפטידים PACAP.

תמונות ניגודיות הפאזה שהתקבלו מראות נדידה מוגברת של נוירוספירה בהשוואה לביקורת. הפרוטוקול שלנו מכיל טכניקות ובדיקות רבות כאשר כל אחת מהן דורשת פרקי זמן שונים. לאחר שליטה, הבדיקה הממוצעת יכולה להימשך בין שעתיים לשלוש להתקנה ובין 30 דקות לשלוש שעות לניתוח.

בעת ביצוע הליכים אלה, חשוב לוודא שאתה משתמש בתאי מבשר עצביים באיכות גבוהה, וכי תאים אלה מנותקים לחלוטין ומופצים באופן אחיד בכל התנאים למעט בדיקת הנוירוספרה. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע ניתוחים אחרים כולל Western Blotting, QRT-PCR, טרנסקריפטומיקה, פרוטאומיקה ומטבולומיקה על מנת לאפיין את המנגנונים הבסיסיים. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.