פרוטוקול ניסיוני לזיהוי תפקוד מיטוכונדריאלי בהפטוציטים שנחשפו לחומרי הדברה אורגנוכלורין

זה מסר שמתקשר לענות על שאלת מפתח שיש לך גם פונקציה של שדה כגון רמת ATP ואת שיעורי צריכת החמצן. החדש או הישן בעמוד אחד, טכניקה זו היא שזה קל לבצע וזה הרבה להערכה מיוחדת של תפקוד המיטוכונדריאלי הסלולר. כדי להתחיל את הניסוי הזה, זרע 20, 000 תאי HepG2 בצלחת פטרי בתחתית זכוכית.

הוסף בטא-hexachlorcyclohexane או B-HCH באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים CO2 במשך 24 שעות. הכן פתרון בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי אחד על ידי הוספת DMSO נטול מים למדיום תרבות התאים של DMEM. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד למנה של פתרון זה לתאים במנות פטרי תחתון זכוכית.

ותגרה ב-37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את פתרון בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי מהתאים. מוסיפים מיליליטר אחד למנה של טרי מוכן ב 37 מעלות צלזיוס DMEM תאים בינוני.

כדי לזהות פלואורסצנטיות ירוקה במיטוכונדריה, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי. כדי להעריך את רמות ATP הסלולר, זרע ל 20, 000 תאי HepG2 בשש צלחות גם. מוסיפים בטא-HCH ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.

הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לתאים בכל באר. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהמשיך עם איסוף על טבעי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 100 מאגר זיהוי ATP microliters לצלחת.

הוסף 100 מיקרוליטרים של תא שנאסף על-טבעי לצלחת באר 96 בטמפרטורת החדר והמשיך לזהות ATP סלולרי על ידי מד זוהר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. להערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי, לגדל תאי HepG2 בשש צלחות גם עם תוספת של בטא HCH, כפי שתואר קודם לכן. לאסוף את התאים על ידי עיכול אותם עם 0.5 מיליליטר 0.25% EDTA במשך דקה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.

הוסף DMEM מיליליטר אחד כדי לעצור את העיכול ולהעביר את התאים המתעכלים לצינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. לדלל את גלולת התא עם 0.5 מיליליטר של תאים בינוני ו 0.5 מיליליטר JC1 מיטוכונדריאלי קרום צבע פוטנציאלי.

ודגירה במשך 20 דקות ב37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 600 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את גלולת התא על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר צנטריפוגה גלולה שטף, להסיר את supernatant.

ולהשעות מחדש את גלולה ב 0.5 מיליליטר של חיץ צביעה JC1. נתח את התאים המוכתמים JC1 באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לזהות פלואורסצנטיות ירוקה ואדום. כאשר מונומר JC1 מזוהה, להגדיר את אור העירור ל 490 ננומטר ואת אור הפליטה ל 530 ננומטר.

כאשר פולימר JC1 מזוהה, להגדיר את אור העירור ל 525 ננומטר ואת אור הפליטה ל 590 ננומטר. כדי לנתח את קצב צריכת החמצן, זרע תאי HepG2 בצלחת תרבות תאים 96 היטב בצפיפות של 4, 500 תאים לכל 100 microliters ל הבאר. לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, ודא כי התאים בכל באר מכוסים בינוני.

לפני הפעלת תוכנת זיהוי תווים אופטי (OCR) , טען את המיקרו-פלטה עם המחסנית ואת לוחית תא התרבות לתוך מנתח שטף חוץ-תאי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פתח את תוכנת זיהוי תווים אופטי (OCR) ובתפריט הנפתח של האפליקציות, בחר בערכת בדיקת הלחץ של ה-mito של התא ולחץ על לחצן אפליקציית 'התחל'. לאחר מכן, לחץ על כפתור בדיקת הלחץ לרוץ.

כאשר מופיע מסך בדיקת הלחץ של התא, הזן את מספר התאים שזורעים ל הבאר בתיבה מספר זריעת תאים ואת זיהוי תווים אופטי (OCR) הממוצע בתיבה ממוצעת של זיהוי תווים אופטי (OCR) של תאים בזלתיים. הזן את ריכוז העבודה הסופי עבור כל רהגנט ולאחר מכן להזריק את reagents. לחץ על הכפתור הבא.

כאשר מסך פרטי הקבוצה מופיע, הקצה קבוצה ל בארות שלא הוקצו על-ידי בחירת צבע ומתן שם. לאחר מכן לחץ על הבאר המתאימה. לחץ על הכפתור הבא ובמסך פריסת הזרקת מבחן הלחץ שמופיע, לחץ על להתחיל להפעיל את בדיקת הלחץ על המנתח.

לאחר הריצה שהושלמה, בצע את ההנחיות בתוכנה ולאחר מכן הסר ומחק את המחסנית ואת לוח התא. העוצמה הממוצעת של כתמי פלואורסצנט ירוק מיטוכונדריאלי ירד בתאי HepG2 חשופים בטא HCH. זה מראה כי יש ירידה במספר המיטוכונדריה וגידול המיטוכונדריה פגום עולה בקנה אחד עם הגידול בריכוז חומרי הדברה.

יתר על כן, רמות ATP בתאי HepG2 ירדו עם ריכוזים מוגברים של חשיפה בטא HCH, מראה את הפונקציה ירדה של המיטוכונדריה בתאים אלה. לאחר כתמי JC1 עבור פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי, או MMP, ציטומטר זרימה הראה פלואורסצנטיות JC1 ירוק אדום גבוה בתאי HepG2 שלמים. זאת בשל נוכחותם של אגרגטים אדומים פלואורסצנטיים JC1, שהם סימן של MMP גבוה.

בתאים שטופלו בבטא-HCH, פלואורסצנטיות JC1 ירוקה אדומה ירדה עקב נוכחות של מונומרים ירוקים פלואורסצנטיים JC1, סימן של MMP נמוך. לבסוף, שיעור צריכת החמצן ירד גם עם הריכוזים המוגברים של חשיפה בטא HCH, עוד יותר מראה כי הדברה זו פוגעת בתפקוד המיטוכונדריאלי תקין. נו, טוב, לנסות להליך זה, זה חשוב אם כי, לזכור לראות את התאים המתאימים כדי לבדוק את זה.

לאחר התפתחותו, זה בהחלט סולל דרך למחקרים בתחום התפקוד הבסיסי לחקור אורגניזמים רלוונטיים בתפקיד הרפואי הקשור אליו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לזהות כמות או איכות, קיבולת, עכשיו חבר או פוטנציאל תחת פונקציית גיליון זרבובית.