בידוד ואפיון של נויטרופילים, נגזר Microparticles ללימודי פונקציונלי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבודד ולאפיין מיקרו-חלקיקים שמקורם בנויטרופילים למחקרים פונקציונליים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידן של שלפוחיות תאים, או מיקרו-חלקיקים, בתקשורת תא-תא בתהליכים פיזיולוגיים שונים כולל סרטן, דלקת וריפוי פצעים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מהירה יחסית, חסכונית, ושהיא מאפשרת להעריך את ההרכב הפנוטיפי של מיקרו-חלקיקים, או מיקרו-שלפוחיות, בנכסים פונקציונליים.

ידגימו את ההליך אריאל פינקלשטיין, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי, וג'וזף לי, סטודנט לתואר ראשון במעבדה שלי. להפרדת שיפוע צפיפות של תאי פולימורפו-גרעיניים של מח עצם עכבר, או PMN, תחילה שכבה איטית של שלושה מיליליטר של תמיסה טרייה, בטמפרטורת החדר, 1.077 גרם למיליליטר על פני שלושה מיליליטר של תמיסת צפיפות טרייה, בטמפרטורת החדר, 1.119 גרם לתמיסת צפיפות מיליליטר בצינור חרוטי אחד של 15 מיליליטר לכל דגימות תאי מח עצם. לאחר מכן שכבו מיליליטר אחד של תאי מח עצם מבודדים טריים ב-PBS קר כקרח על שכבת שיפוע הצפיפות העליונה של כל צינור, והפרידו את התאים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות.

בתום ההפרדה, הסר בזהירות את שכבות התאים החד-גרעיניים בממשקים בין PBS לשכבות השיפוע בצפיפות העליונה בכל צינור מבלי להפריע לרצועות ה-PMN. בעזרת פיפטת העברה, אספו את שכבות ה-PMN לצינור חדש אחד של 15 מיליליטר לכל דגימה, והביאו את הנפח הסופי בכל צינור עד 15 מיליליטר עם PBS מסונן בגודל מזיגה של 0.1 מיקרון. גלולה את ה-PMNs על ידי צנטריפוגה, ואחריה צנטריפוגה שנייה בשני מיליליטר PBS מסונן טרי לכל צינור.

לאחר מכן השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של PBS מסונן טרי לספירה. לאחר הספירה, יש לצנטריפוגה שוב של התאים, ולהשעות מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של HBSS מסונן בגודל 0.1 מיקרון, בתוספת החומר הממריץ המעניין לכל 10 מיליון תאים. דוגרים במשך 20 עד 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הגירוי, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה והעבירו את הסופרנטנטים נטולי התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש אחד של 1.5 מיליטר לדגימה. צנטריפוגה של הסופרנטנטים כדי להסיר כל פסולת תאים, ולהעביר את הסופרנטנטים המנוקים לתוך צינורות אולטרה-צנטריפוגות חדשים, ואז לאחסן את המיקרו-חלקיקים הגלוליים בצינורות אולטרה-צנטריפוגות אטומים בפרפין בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח ניסיוני נוסף. כדי להחדיר את המיקרו-חלקיקים למעי הגס של העכבר, יש להניח תחילה עכבר מורדם לחלוטין במצב שכיבה, ולהשתמש במלקחיים ביופסיה ובאנדוסקופ המצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה כדי ליצור שלושה עד חמישה פצעים שטחיים לאורך הצד הגבי של המעי הגס.

החזר את העכבר לכלוב שלו עם ניטור עד להחלמה מלאה. 24 שעות לאחר מכן, השתמש באנדוסקופ כדי לקבל תמונות של הפצעים שנגרמו בהרדמה. לאחר מכן השתמש במערכת מיקרו-הזרקה מבוססת קולונוסקופיה כדי לנהל נפח ניסיוני של מיקרו-חלקיקי PMN שהושעו מחדש ב-100 מיקרוליטר של HBSS ישירות לכל אתר פצע.

ניתן להעריך את הטרוגניות הגודל של מיקרו-חלקיקי PMN על ידי השוואת המיקרו-חלקיקים לחרוזי ציטומטריית זרימה בגודל ידוע. כפי שהודגם, ניתן לבחון את ביטוי החלבונים המעניינים על ידי המיקרו-חלקיקים גם על ידי זרימה ציטומטרית. בניסוי זה, הביטוי של מולקולות דלקתיות ואנטי דלקתיות מרכזיות על ידי מיקרו-חלקיקים שמקורם ב-PMN מגורים על ידי אקטיבטור הוערך על ידי Immunoblot.

ניתן לנטר את ההשפעות של מיקרו-חלקיקי PMN על ריפוי תאי אפיתל על ידי רכישת תמונה של חד-שכבות אפיתל פצועות שריטות בנקודות זמן קבועות מראש במבחנה, כמו גם לאחר פציעת מלקחיים ביופסיה in vivio. לאחר השליטה, ניתן לבודד מיקרו-חלקיקים שמקורם ב-PMN תוך ארבע שעות, אם הטכניקה מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלפני הגירוי, יש לשמור את ה-PMN על קרח כדי למנוע הפעלה מוקדמת ואובדן מיקרו-חלקיקים.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות זרימה ציטומטריה, אימונובלוטינג ותגובת התפשטות בזמן אמת כדי להגדיר את תכולת המיקרו-חלקיקים, בתנאים מעוררים שונים, או מתאי מקור שונים. טכניקה זו שימושית לבחינת תפקיד תרומת המיקרו-חלקיקים בוויסות תגובות חיסוניות, תפקוד מחסום, פגיעה ברקמות ותיקון, כמו גם בהתקדמות הסרטן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתייג מיקרו-חלקיקים של עכברים ולהשתמש במיקרו-חלקיקים בנכס פונקציונלי לריפוי פצעים in vivo.

אל תשכח שעבודה עם בעלי חיים עלולה להיות מסוכנת, וכי אמצעי זהירות המציעים ללבוש את ציוד המגן האישי ולהשלים את הדרכות הבטיחות המתאימות יש לנקוט תמיד לפני ביצוע הליך זה.